[Chia sẻ] Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất kháng sinh

Bài viết sau đây, nhà thuốc Ngọc Anh xin chia sẻ về ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất kháng sinh.

Đại cương về kháng sinh

Định nghĩa

Kháng sinh là các chất được phân lập từ các vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có khả năng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. Mỗi loại kháng sinh đều có một cơ chế riêng để tác dụng lên vi khuẩn như ức chế tổng hợp vách, ức chế phiên mã, ức chế tế bào nhân lên…

Lịch sử

Kháng sinh đầu tiên salvarsan được đưa vào sử dụng năm 1910, chỉ khoảng 100 năm sau kháng sinh đã làm thay đổi mạnh mẽ ngành dược phẩm và kéo dài tuổi thọ trung bình của loài người thêm 23 năm.  Năm 1928, nhà khoa học alexander fleming đã khám phá ra penicillin một cách rất tình cờ từ nấm mốc penicillium. Tuy nhiên, cũng phải mất một thập kỷ tiếp theo, penicillin mới được sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn. Và phải đến năm 1945, penicillin được đưa vào sản xuất quy mô lớn nhờ các nghiên cứu giúp tách chiết được penicillin và nâng cấp quy mô sản xuất. Việc khám phá ra penicillin đã mở ra thời kỳ vàng “the golden age” của việc khám phá kháng sinh tự nhiên- cái đã đạt đến đỉnh cao vào giữa những năm 1950. Phần lớn các nhóm kháng sinh được phát hiện và sử dụng trong lâm sàng thời kì này. Mỗi nhóm đều chứa đựng nhiều kháng sinh- được khám phá một từ vi sinh vật hoặc được biến đổi từ các kháng sinh thế hệ trước đó. Sau thời kì này, các kháng sinh mới được phát triển bắt đầu giảm dần và tình trạng vi khuẩn kháng lại kháng sinh ngày càng tăng. Viễn cảnh nhân loại không còn kháng sinh sử dụng là điều không thể tránh khỏi, nếu chúng ta không biết sử dụng kháng sinh một cách hợp lý.

Phân loại kháng sinh

Kháng sinh được phân loại thành 9 nhóm:

• Kháng sinh beta lactam: kháng sinh này đặc trưng bởi vòng 4 cạnh B-lactam. Nhóm này là nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất, lớn nhất và ít tác dụng không mong muốn nhất, tuy nhiên nó hay gây tình trạng quá mẫn (có thể shock phản vệ). Nhóm này lại được phân thành các nhóm nhỏ hơn như penicilin, cephalosporin, carbapenem, monobactam.
• Kháng sinh nhóm aminoglycosid: như streptomycin, amikacin, kanamycin,… nhóm này có nhược điểm là gây tổn thương trên thận và thính giác.
• Kháng sinh macrolid: như roxithromycin, clarithromycin, azithromycin, erythromycin.
• Kháng sinh lincosamid: nổi bật là clindamycin, lincomycin.
• Kháng sinh phenicol: như chloramphenicol.
• Kháng sinh tetracycline: như tetracycline, doxycycline, clo tetracycline.
• Kháng sinh peptid gồm các nhóm nhỏ hơn như glyco peptid, polypeptid và lipopeptide như vancomycin.
• Kháng sinh quinolon: kháng sinh này có 4 thế hệ (1,2,3 và 4).

• Nhóm 9: nhóm các kháng sinh khác như oxazolidinon, 5-nitroimidazol…

Các phương pháp sản xuất kháng sinh

Có 3 phương pháp thông thường để sản xuất kháng sinh:

Kháng sinh sản xuất từ sinh tổng hợp

Kháng sinh được sản xuất từ vi sinh vật là một trong những phương pháp phổ biến nhất. Hơn 10000 kháng sinh và chất chuyển hóa có hoạt tính tương tự đã được phân lập từ vi khuẩn với xấp xỉ 500 lớp mới của các phân tử lượng thấp được công bố mỗi năm. Về phương diện kinh tế, kháng sinh là nhóm quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học với doanh thu ước đoán vượt quá 15 tỷ đô la. Các nhóm kháng sinh đầu tiên được sản xuất theo phương pháp này như cephalosporin, penicillin, tetracyclin. Phần lớn các chúng được xuất từ xạ khuẩn hoặc nấm mốc, các vi khuẩn bacillus. Các kháng sinh này không chỉ được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn mà còn được sử dụng trong nông nghiệp và thu y. Ngày nay, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật như công nghệ DNA tái tổ hợp- dựa trên hệ thống chuyển gen, các nhà khoa học đã có thể chuyển các gen mã hóa cho kháng sinh sang một sinh vật khác có các ưu điểm như dễ nuôi cấy, sinh trưởng mạnh, tạo sản phẩm cao hơn so với vi sinh vật chứa gen đó ban đầu. Ví dụ điển hình là gen mã hóa sản xuất kháng sinh Beta-lactam trong nấm mốc  P. chrysogenum.

Kháng sinh sản xuất từ bán tổng hợp

Phương pháp này dựa trên cấu trúc các kháng sinh tự nhiên, sau đó thực hiện các phản ứng hóa học để gắn thêm các nhóm chức, tạo muối để tăng độ tan, sinh khả dụng, ngăn vi sinh vật kháng thuốc hay giảm các tác dụng không mong muốn. Các kháng sinh bán tổng hợp là các kháng sinh thế hệ sau của các nhóm kháng sinh tự nhiên như penicillin- gắn thêm các nhóm khác nhau vào khung 6-APA, cephalosporin- gắn thêm các nhóm vào khung 7-ACA hoặc 7-ADCA, aminoglycosid, macrolid

Kháng sinh tổng hợp

Các kháng sinh này được tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học, như kháng sinh sulfamid hoặc quinolon, phenicol.

Sản xuất kháng sinh từ vi sinh vật

Sản xuất kháng sinh Beta- lactam

Chuẩn bị trước lên men:

Chủng giống: nấm mốc P.chrysogenum. Thuộc họ nấm cúc và chi mốc xanh. Sinh trưởng tốt trong môi trường mát với nhiệt độ từ 24 đến 30 độ c, pH hơi acid (từ 6,0 đến 6,5) và rất hiếu khí.

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng:

• Nguồn hidrocacbon: ưu tiên sử dụng các loại đường đơn hoặc đôi (tan được, vi sinh vật dễ dàng đồng hóa) hay sử dụng như glucose, lactose. Thường sử dụng glucose trong 48 giờ đầu để vi sinh vật phát triển sinh khối, sau đó bổ sung lactose- để tập trung tạo khung Betalactam. Nếu cứ bổ sung glucose, vi sinh vật sẽ chỉ phát triển sinh khối mà không tạo sản phẩm. Bên cạnh việc cung cấp năng lượng cho sự phát triển và tồn tại của P.chrysogenum, chúng còn cung cấp mạch carbon cho kháng sinh. Ngoài hai loại đường trên, có thể sử dụng một số nguồn hiđrocacbon khác như saccharose, tinh bột, dextrin, một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic (nguồn ngày ngoài cung cấp năng lượng cho vi nấm phát triển, chúng còn cùng cấp nhóm carboxyl cho kháng sinh).
• Nguồn Nitơ: có thể sử dụng 2 nguồn là nguồn vô cơ như các muối amoni, nitrat…; nguồn hữu cơ như các acid amin (trong cao ngô hay bột lạc)… Môi trường cần giàu nitơ không chỉ cung cấp năng lượng hay vật chất để tế bào sinh trưởng, phát triển. Nguồn Nitơ còn cung cấp nhóm amin cho kháng sinh.
• Các nguyên tố vi lượng: như magie, mangan, sắt, đồng, natri, kẽm… – các kim loại này cấu tạo trong các coenzym xúc tác cho các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật. Các nguyên tố này được bổ sung qua cao ngô hoặc tận dụng thành phần trong nước máy.
• Lưu huỳnh: sử dụng các nguồn vô cơ như muối natri hoặc kali sulfat; natri thiosulfat. Lưu huỳnh không chỉ là thành phần thiết yếu của các đơn vị cấu tạo của tế bào (như acid amin, protein) nó còn cung cấp nguyên tố lưu huỳnh để tổng hợp tạo sản phẩm.
• Chất tiền thể: được thêm vào để định hướng loại kháng sinh muốn tạo thành. Các chất này sẽ cung cấp nhóm R vào khung 6-APA. Ví dụ acid phenylacetic định hướng tạo penicillin G; acid phenoxyacetic: định hướng tạo penicillin V. Ngoài ra, cao ngô cũng được coi là chất tiền thể, với nồng độ sử dụng khoảng 2%.
• Chất điều chỉnh pH: điều chỉnh và ổn định pH của môi trường thích hợp (từ 6 đến 6,5) để giúp vi nấm phát triển tốt và tạo sản phẩm.
• Dầu phá bọt: phá bọt trong quá trình lên men. Do P.chrysogenum là sinh vật hiếu khí, nên phải sục khí O2 trong quy trình, ngoài ra quá trình lên men cũng cần khuấy trộn để phân tán đều môi trường và tránh các vi nấm tụ vào nhau. Nếu trong quá trình nuôi cấy, bọt quá nhiều sẽ cản trở khả năng tiếp xúc của vi nấm với oxy và dinh dưỡng, bọt trào ra ngoài thành ống, cũng là nguy cơ dẫn đến nhiễm khuẩn quy trình.

Quá trình lên men: có 2 phương pháp lên men được sử dụng là lên men bề mặt và lên men chìm.

Lên men bề mặt: có thể sử dụng môi trường bán rắn (hạt hoặc cám- cần có độ xốp cao) hoặc môi trường lỏng (trong chai Roux, có thể tận dụng váng tạo thành để lên men lần 2):

• Điều kiện lên men: duy trì nhiệt độ hằng định trong khoảng từ 24 đến 30 độ C (vi sinh vật ưa mát) trong thời gian từ 6-7 ngày (vì kháng sinh là sản phẩm bậc 2 nên cần thu ở cuối pha cân bằng). Tiến hành cấp khí vô trùng liên tục trên bề mặt (với môi trường rắn có thể kết hợp với đảo trộn bằng trống quay để tăng tiếp xúc không khí).
• Ưu điểm: dễ tiến hành, xử lý cục bộ dễ dàng, dụng cụ đơn giản.
• Nhược điểm: hiệu suất thấp (< 200 UI/ml), khó đảm bảo điều kiện vô trùng, khó đảm bảo sự đồng nhất giữa các dụng cụ nuôi cấy.
• Ứng dụng: vì khó đảm bảo độ vô trùng, độ đồng nhất kém nên chỉ sử dụng dịch lọc penicillin để rửa vết thương.

Lên men chìm: phương pháp này được sử dụng lần đầu vào năm 1947.

• Trong pha sinh trưởng: đồng hóa glucose cao hệ sợi phát triển nhanh, sinh khối tăng mạng. Nên sử dụng nguồn hydrocarbon là 2 loại đường glucose và lactose với tỉ lệ 1:1 (sử dụng thêm lactose để định hướng P.chrysogenum tạo kháng sinh, không sẽ chỉ tập tập trung phát triển sinh khối); tiến hành sục khí với tốc độ cao từ 1,2 đến 1,5 VVM (do nhu cầu oxy lớn), cần chú ý đến lượng bọt tạo thành. Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường sẽ tăng lên, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi nấm, ảnh hưởng đến hiệu suất, cần giám sát và điều chỉnh pH thường xuyên.
• Pha sinh kháng sinh (cuối pha sinh trưởng và pha cân bằng): Sinh khối trong pha này phát triển chậm lại, kháng sinh được tạo thành. Trong giai đoạn này, nếu glucose hết, cần tiến hành bổ sung lactose (không bổ sung glucose); điều chỉnh pH tăng lên trung tính từ 7.0 đến 7.5- pH ngoài ổn định sản phẩm, nó còn hạn chế sự phát triển sinh khối, giúp vi nấm P.chrysogenum tập trung tạo sản phẩm. Trong giai đoạn này, cần bổ sung chất tiền thể để định hướng tạo kháng sinh như acid phenylacetic, acid phenoxyacetic. Cuối giai đoạn này, hệ sợi tự phân thành các đoạn nhỏ, pH tăng dần lên trên  8.0, tổng hợp kháng sinh giảm dần.

Thu sản phẩm:

• Kháng sinh là sản phẩm ngoại bào, nên tiến hành lọc, ly tâm để lấy dịch lên men và loại sinh khối. Quá trình này tiến hành ở 4 độ C để giúp ổn định kháng sinh (penicillin rất dễ thủy phân và nhạy cảm với nhiệt).
• Chiết: tiến hành acid hóa về pH 2,5 để chuyển hoàn toàn penicillin về dạng acid (dạng tan nhiều trong dung môi hữu cơ), sau đó chiết với butyl acetat, penicillin sẽ được phân bố sang pha hữu cơ (loại các tạp không tan trong dung môi hữu cơ). Tiến hành cô để loại butyl acetate, thu được dịch đậm đặc.
• Tẩy màu: dịch đậm đặc này được tẩy màu bằng than hoạt, tiến hành lọc để loại than hoạt và thu dịch, loại bớt nước.
• Tiến hành kết tinh ở nhiệt độ thấp, bổ sung NaOH hoặc KOH để chuyển penicillin về dạng muối với natri hoặc kali. Rửa sản phẩm tạo thành với butanol và sấy ở 50 độ C.

Sản xuất cephalosporin C

Chủng giống: xạ khuẩn cephalosporin acremonium.

Quá trình sinh tổng hợp, các điều kiện lên men, thành phần dinh dưỡng tương tự như lên men penicillin.

Sản xuất 6 APA từ lên men vi sinh vật

Có 2 phương pháp là lên men từ penicillium và từ enzyme vi sinh vật:

Lên men từ nấm mốc penicillium: quá trình lên men vi nấm này tương tự lên men các penicillin khác, tuy nhiên cho hiệu suất thấp và quá trình tác chiết cũng rất phức tạp, do có nhiều tạp trong sản phẩm.

Phương pháp enzym vi sinh vật: sử dụng enzyme penicillinamidase để thủy phân chọn lọc các kháng sinh penicillin để thu được khung 6- APA (sản phẩm 6-APA ở đây là sản phẩm chuyển hóa do đi từ tiền chất). Trước tiên, tiến hành chiết lấy enzyme penicillinamidase hoặc penicillin acylase từ vi sinh vật (có thể là xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men, e coli…) để tiến hành phản ứng thủy phân. Enzym này sẽ thủy phân nhóm amid liên kết gốc R với khung 6-APA để thu được khung này. Enzyme từ xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men cho các penicillin amidase ngoại bào, chúng có khả năng thủy phân nhanh các penicillin như K, V, F. Trong khi thủy phân penicillin G chậm gấp 10 lần và điều kiện pH hơi trung tính từ 7.3 đến 8.5. Trong khi đó enzym phân lập từ vi khuẩn E.coli và B. megatherium là enzyme nội bào, thủy phân Penicilin G nhanh và tiến hành ở pH kiềm (pH=9).

• Với E.coli và B.megatherium chứa các enzym nội sinh do đó có thể tiến hành phương pháp cố định tế bào để có thể tiến hành phản ứng liên tục và nhiều lần.
• 6-APA sau khi được tạo thành sẽ được kết tinh ở điểm đảng điện tại pH bằng 4,3 và tinh chế trên sắc ký trao đổi ion.

Sản xuất kháng sinh tetracyclin

Trước lên men:

Chuẩn bị chủng giống: các xạ khuẩn như Str.rimosus, Str.aureofaciens, Str platensis, Str. Gilvus…

Đặc điểm: là vi khuẩn hiếu khí, sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường trung tính (pH từ 6,6 đến 7); là sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 27 đến 28 độ C.

Môi trường dinh dưỡng:

• Nguồn hiđrocacbon: Có thể sử dụng cả đường đơn đôi, hoặc tinh bột (như bột ngô, bột khoai tây hay bột mì). Các nguồn dinh dưỡng này không chỉ cung cấp năng lượng và vật chất cho tế bào sinh trưởng và phát triển, nó còn cung cấp khung carbon cho cấu trúc kháng sinh tetracyclin.
• Nguồn Nitơ: nguồn vô cơ hoặc hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ là các muối của amoni hoặc nitrat (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl. Nguồn Hữu cơ hay sử dụng như cao ngô, bột đậu tương hoặc lạc. Ngoài cung cấp năng lượng và thành phần cho vi sinh vật phát triển, nguồn dinh dưỡng này còn cung cấp nhóm amin trong cấu trúc của kháng sinh.
• Phospho: cũng như nguồn Nitơ, có thể sử dụng nguồn vô cơ hoặc hữu cơ; vô cơ có các muối photphat như KH2PO4, K2HPO4, nguồn hữu cơ có cao ngô. Nguồn phospho rất quan trọng vì nó là thành phần của acid nucleic (tham gia vào phân chia tế bào) liên quan đến quá trình phát triển hệ sợi. Do đó, nếu thiếu photpho hệ sợi sẽ phát triển kém và cho hiệu suất sinh kháng sinh thấp.
• Các nguyên tố vi lượng: như magie, mangan, sắt và đồng. Bổ sung các nguyên tố này dưới dạng muối sulfat. Các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng vì nó tham gia vào hoạt động của enzym cũng như các protein. Cobalt là một chất kích thích sinh trưởng, trong khi nếu thừa sắt sẽ đến tạo phức với tetracyclin làm mất hoạt tính.
• CaCO3: điều chỉnh và ổn định pH của môi trường nuôi cấy từ 6.8 đến 7 – thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn và sinh tổng hợp kháng sinh.
• Dầu phá bọt: vì vi khuẩn hiếu khí, nên cần sục khí trong giai đoạn lên men. Ngoài ra, cần có quá trình khuấy trộn, nên việc tạo bọt sẽ rất mạnh. Cần dầu phá bọt để tránh bọt tràn ra đường ống gây nhiễm khuẩn hoặc cản trở sự phát triển của xạ khuẩn. Tuy nhiên, cần chú ý lượng sử dụng, do là chất thân dầu nên nếu dùng quá nhiều sẽ cản trở trao đổi Oxy của các vi sinh vật lên men.

Quá trình lên men:

• Thực hiện cấp khí với tốc độ 1VVM, đặc biệt quan trọng trong 6 đến 12 giờ đầu vì đây là thời điểm xạ khuẩn phát triển hệ sợi mạnh.
• pH môi trường từ 6.6 đến 7.0: thuận lợi cho sự phát triển xạ khuẩn. Ngoài ra, nếu ở pH quá thấp, tetracyclin dễ tạo thành dạng epi-tetracyclin. Đây là dạng không quá hoạt tính. Còn quá kiềm sẽ tạo dạng anhydro hoặc iso làm mất hoạt tính.
• Nhiệt độ: 27 đến 28 độ C- ưa mát.
• Thời gian nuôi cấy: từ 5 đến 7 ngày. Do kháng sinh là sản phẩm bậc 2, cần thời gian để tổng hợp. Nên được thu vào cuối pha cân bằng.

Giai đoạn thu sản phẩm: Tetracyclin là sản phẩm nội bào, nhưng nó được tiết nhiều ra môi trường trong quá trình nuôi cấy, do đó cần thu cả tế bào và dịch lên lên men. Tiến hành phá vỡ tế bào để giải phóng kháng sinh, sau đó lọc loại bã và cô dịch lọc đến khi đạt hàm lượng xấp xỉ 6 g/l. Dịch lọc thu được sau đó sẽ được chiết bằng các phương pháp thích hợp như kết tủa, chiết 2 pha bằng dung môi hữu cơ hoặc dùng nhựa trao đổi ion. Dịch sau chiết sẽ tiếp tục được kết tinh và tinh chế để thu được các kháng sinh tetracyclin tinh khiết.

Một số lưu ý khi lên men các kháng sinh tetracyclin cụ thể:

• Kháng sinh clotetracyclin: sử dụng chủng giống Str. Aureofacien. Trong môi trường nuôi cấy cần cung cấp ion Clo như NaCl, NH4Cl… do cung cấp nguyên tử clo vào khung của kháng sinh, giúp tăng hiệu suất.
• Kháng sinh tetracyclin: chủng giống như Str. Viridifaciens (hiệu suất thấp), Str. Aureofaciens (hiệu suất cao và dùng trong sản xuất). Trong môi trường nuôi cấy cần có các thành phần như muối bạc, iod, brome hoặc 2- thiouraxyl, các dẫn xuất của acid dithiocacbamic để ức chế quá trình clo hóa để không tạo thành clotetracyclin mà chỉ tạo thành tetracyclin.
• Oxytetracyclin: chủng giống là xạ khuẩn Str. Rimosus. Xạ khuẩn này ưa đường maltose và có khả năng đồng hóa chất béo nhanh, do đó có thể sử dụng dầu phá bọt ngay từ đầu, để xạ khuẩn sử dụng làm nguồn cung cấp dinh dưỡng.

Sản xuất kháng sinh streptomycin

Chuẩn bị trước lên men:

Chủng giống: xạ khuẩn str. Grisesus

Đặc điểm: vi sinh vật hiếu khí (quá trình nuôi cấy cần cung cấp khí với tốc độ từ 0.8 đến 1.0 VVM); quá trình nuôi cấy sinh ra các sợi mạnh dẫn đến khó khăn cho quá trình lọc; dễ nhiễm phage trong quá trình nuôi cấy (khi nhiễm phage sẽ làm cho vỡ tế bào vi sinh vật, sinh ra nhiều tạp và hiệu suất giảm), do đó cần tiệt trùng kĩ môi trường và thiết bị cũng như kiểm soát chặt quá trình nuôi cấy; Xạ khuẩn là vi sinh vật ưa mát với nhiệt độ nuôi cấy từ 26 đến 28 độ C; pH hơi trung tính từ 6,8 đến 7.0; dinh dưỡng ưa các môi trường giàu Nitơ nhiều acid amin…

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

• Nguồn hidrocacbon: sử dụng được các phân tử đường tan được như glucose, dextrin, maltose, fructose và cả các hidrocacbon không tan như tinh bột (do có men amylase phân hủy). Các chất dinh dưỡng này không chỉ cung cấp năng lượng và các thành phần để vi sinh vật phát triển sinh khối mà nó còn tham gia trực tiếp vào phân tử kháng sinh (khung carbon). Tuy nhiên, trong môi trường có quá thừa glucose, sẽ làm giảm hiệu suất của quá trình do tạo manizidostreptomycin. Do str. Grisesus có chứa men protease, nen chúng đồng hóa rất tốt các bột đậu tương, bột lạc, bột cá, men bia…
• Nito: sử dụng được cả nguồn hữu cơ và vô cơ. Nguồn vô cơ hay dùng là các muối amoni (không nên sử dụng các muối nitrat) và nguồn hữu cơ sử dụng các thành phần giàu đạm như cao ngô, bột đậu và cao nấm men. Nguồn này không chỉ cung cấp năng lượng, thành phần để vi sinh vật phát triển, mà còn cấu tạo nên thành phần của kháng sinh- cung cấp các acid amin.
• Phospho: sử dụng nguồn vô cơ từ muối của KH2PO4. Phospho tham gia vào nhiều thành phần trong tế bào như các nucleotide, protein…
• CaCO3: giúp ổn định pH của môi trường, tạo điều kiện để str. Grisesus sinh trưởng và phát triển.
• Dầu phá bọt: được thêm vào để hạn chế bọt tạo thành do khuấy trộn và cấp khi cho str. Grisesus hô hấp.
• Tiền chất: chưa xác định được các thành phần này.
• Vi lượng: sử dụng các nguyên tố như magie, mangan, đồng, sắt, có thể bổ sung chúng dưới dạng muối, dạng sulfat. Trong một số nguồn N2 như cao ngô, bột đậu, bột lặc cũng đã có chứa các chất này, nên có thể chỉ cần bổ sung một lượng nhỏ các muối vô cơ.
• NaCl: ngoài ổn định áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trường, và duy trì điện thế của tế bào. Natri clorid còn giúp tăng hiệu suất tổng hợp kháng sinh.

Quá trình nuôi cấy: tiến hành cấp khí với tốc độ 0.8 đến 1.0 VVM, kiểm soát nhiệt độ từ 26 đến 28 độ C với pH môi trường từ 6.8 đến 7.0; thời gian nuôi cấy từ 4 đến 5 ngày- tương ứng với cuối pha sinh trưởng (vì kháng sinh là sản phẩm bậc 2). Trong quá trình nuôi cấy, để tránh bị nhiễm phage, cần lấy mẫu kiểm tra 4 giờ/ lần để xác định xem có nhiễm phage hay không.

Sau nuôi cấy: vì streptomycin là sản phẩm nội bào và một phần được tiết ra ngoài trong quá trình nuôi cấy, do đó cần thu cả dịch chiết và sinh khối. Tiến hành hạ nhiệt xuống 8 độ C (ổn định sản phẩm), phá vỡ tế bào để giải phóng hoạt chất (có thể bằng acid hoặc bằng bazơ). Tiến hành lọc thu lấy dịch chứa kháng sinh. Dịch lọc sau đó được loại các ion kim loại như Magie, Canxi bằng cách tạo tủa với oxalic. Tủa này được lọc và loại đi, dịch lọc thu được sẽ được điều chỉnh về pH từ 7.0 đến 7,5 để kết tủa protein, lọc loại protein sẽ thu được dung dịch streptomycin.

Dung dịch streptomycin thu được được tiếp tục tinh chế băng hấp phụ qua cột cacboxyl cationit với tốc độ 800l/ giờ. Sau đó được phản hấp phụ bằng H2SO4 5%, thu được các phân đoạn, trong đó phân đoạn 3 cho hàm lượng cao nhất, các phân đoạn khác hàm lượng thấp hơn sẽ được tiếp tục hấp phụ và phản hấp phụ. Phân đoạn 3 tiếp tục được tinh chế và tẩy màu, loại muối, cô chân không để thu được streptomycin tinh khiết.

Tài liệu tham khảo

Slide bài giảng “công nghệ vi sinh”-PGS.TS Đàm Thanh Xuân và Th.S Lê Ngọc Khánh- Trường Đại học Dược Hà Nội.

Antibiotics: past, present and future, ScienceDirect, truy cập ngày 7/6/2023.

Xem thêm: [Chia sẻ] Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất các vitamin B12