Tiệt khuẩn là gì? Các phương pháp tiệt khuẩn ứng dụng trong sản xuất thuốc

Tác giả: Tiến sĩ Dược sĩ Nguyễn Văn Hân.

Bài viết Tiệt khuẩn là gì? Các phương pháp tiệt khuẩn ứng dụng trong sản xuất thuốc trích trong chương 7 sách Một số quá trình và thiết bị trong công nghệ dược phẩm – giáo trình đào tạo dược sĩ đại học bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội.

Mục tiêu học tập:

1. Trình bày được khái niệm và các nguyên lý tiệt khuẩn.
2. Trình bày được nguyên tắc, ưu nhược điểm, ứng dụng một số phương pháp tiệt khuẩn.

1. Khái niệm

Các chế phẩm thuốc nói chung không được nhiễm vi sinh vật (vi khuẩn, virus, nấm men, nấm mốc…). Các vi sinh vật này có thể gây ra những tác động có hại, làm biến đổi hình thức và thành phần của thuốc, dẫn đến những ảnh hưởng bất lợi cho người dùng. Các tác dụng bất lợi càng dễ xảy ra khi thuốc được đưa vào cơ thể qua những đường dùng vượt qua cơ chế bảo vệ thông thường của cơ thể, nhất là trường hợp bệnh nặng hoặc suy giảm miễn dịch.

Các dạng thuốc tiêm, nhỏ mắt, thuốc dùng trong phẫu thuật cũng như các thuốc dùng ngoài trên vết thương hở, phải vô khuẩn và không chứa tạp cơ học. Những sản phẩm này cần được pha chế và bảo quản ở trạng thái vô khuẩn cho đến khi sử dụng.

Các sản phẩm vô khuẩn được chia thành hai nhóm theo phương pháp sản xuất: 1) Sản phẩm được tiệt khuẩn ở giai đoạn cuối của quy trình sản xuất, trong bao bì cuối và 2) sản phẩm được sản xuất vô khuẩn, không tiệt khuẩn được ở giai đoạn cuối.

Người thực hiện các quá trình tiệt khuẩn cần biết rõ về hiệu quả cũng như những hạn chế của mỗi quá trình tiệt khuẩn. Ngoài ra, mỗi quá trình tiệt khuẩn có thể có những ảnh hưởng bất lợi đối với sản phẩm cần tiệt khuẩn. Trong các quá trình sản xuất dược phẩm, thường phải chọn một chế độ tiệt khuẩn sao cho dung hòa được hiệu quả tiệt khuẩn mà không ảnh hưởng bất lợi đáng kể đến sản phẩm. Ví dụ khi tiệt khuẩn bằng nhiệt một sản phẩm kém ổn định với nhiệt, có thể thêm vào sản phẩm một chất kháng khuẩn để tăng hiệu quả tiệt khuẩn, qua đó có thể giảm được nhiệt độ và thời gian tiệt khuẩn, hạn chế được sự phân hủy sản phẩm do nhiệt.

Một số thuật ngữ liên quan:

• Vô khuẩn (vô trùng, sterile): Một sản phẩm được coi là vô khuẩn nếu nó hoàn toàn không chứa bất kỳ vi sinh vật sống nào. sản phẩm vô khuẩn có thể được sản xuất bằng kỹ thuật vô khuẩn hoặc bằng cách tiệt khuẩn ở giai đoạn cuối.
• Tiệt khuẩn (tiệt trùng, sterilization): Là làm cho một sản phẩm trở thành vô khuẩn, bằng cách đưa sản phẩm vào một quá trình qua đó tất cả các dạng sống của sinh vật bị tiêu diệt hoặc loại bỏ.
• Kỹ thuật vô khuẩn (aseptic technique): Là quá trình sản xuất một sản phẩm từ những nguyên liệu vô khuẩn bằng quy trình sao cho tránh được sự xâm nhập của các vi sinh vật sống vào sản phẩm. Kỹ thuật này thường được áp dụng cho những sản phẩm dễ bị ảnh hưởng bất lợi trong quá trình tiệt khuẩn.
• Thử vô khuẩn (sterility testing): Thử nghiệm nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn.
• Khử khuẩn (khử trùng, disinfection): Là quá trình nhằm làm giảm số lượng vi sinh vật có hại (gây bệnh), thường bằng cách dùng hóa chất. Khử khuẩn có tác dụng phá hủy dạng sinh dưỡng của của vi sinh vật nhưng có thể không diệt được dạng bào tử đề kháng. Khử khuẩn không phải là quá trình tuyệt đối như tiệt khuẩn.
• Chất khử trùng (disinfectant): Tác nhân hóa học thường dùng để tiêu diệt vi sinh vật có hại trên vật dụng.
• Chất sát khuẩn (antiseptic): Tác nhân hóa học thường dùng trên mô sống của người hoặc động vật để tiêu diệt vi khuẩn có hại.
• Tác nhân tiệt khuẩn (sterilant): Tác nhân hóa học, vật lý dùng để diệt cả dạng sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật.

2. Các nguyên lí tiệt khuẩn

2.1. Vi sinh vật nhiễm ban đầu (bioburden, bioload)

Để chọn được các thông số thích hợp của một phương pháp tiệt khuẩn cho một sản phẩm nhất định, cần biết số lượng vi sinh vật có ban đầu và khả năng chịu đựng của vi sinh vật đó đối với tác nhân tiệt khuẩn đã chọn.

Vi sinh vật có sức đề kháng rất khác nhau đối với các quá trình tiệt khuẩn. Hơn nữa, các bào tử, là dạng bảo vệ vi sinh vật trong điều kiện bất lợi, đề kháng tốt hơn dạng sinh dưỡng. Bảng 7.1 cho thấy mức độ đề kháng khác nhau của một số bào tử với nhiệt ẩm và nhiệt khô. Do vậy, các điều kiện tiệt khuẩn cần chọn sao cho đảm bảo diệt được các bào tử đề kháng mạnh nhất thường gặp. Trên thực tế, các thông số tiệt khuẩn thường lớn hơn rất nhiều so với thông số cần thiết để diệt các vi sinh vật có thể có trong chế phẩm.

Bảng 7.1. Thời gian tiệt khuẩn cần thiết đối với một số bào tử (phút)

Bào tử	Nhiệt ẩm			Nhiệt khô
	100°C	110°C	121°C	120°C	140°C	170°C
Bacillus anthracis	5-15				180
Clostridium botulinum	330	90	10	120	60	15
Clostridium welchii	5-10			50	5	7
Clostridium tetani	5-15				15
Soil bacilli	> 1020	120	6			15

Sự bất hoạt (chết) của vi sinh vật trong một quần thể được xác định bằng cách đánh giá mức giảm số lượng vi sinh vật sống khi tiếp xúc với tác nhân tiệt khuẩn. Vi sinh vật sống là những vi sinh vật khi chuyển sang môi trường nuôi cấy có thể tạo được khuẩn lạc. Điều này đặt ra nhiệm vụ cho người nghiên cứu phải chọn ra được các môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để vi sinh vật còn sống sót có thể phục hồi và phát triển được.

2.2. Động học quá trình bất hoạt vi sinh vật

Động học bất hoạt vi sinh vật trong quá trình tiệt khuẩn bằng tác nhân vật lý và hóa học tuân theo qui luật hàm số mũ. Nghĩa là một tỉ lệ không đổi vi sinh vật bị bất hoạt trong một khoảng thời gian bất kỳ. Hình 7.1 thể hiện một đường sống sót điển hình của quá trình tiệt khuẩn.

Nếu N₀ là số lượng vi sinh vật ban đầu và N_t là số lượng vi sinh vật sống sót sau thời gian tiệt khuẩn t, động học quá trình bất hoạt vi sinh vật có thế được mô tả bởi phương trình:

N_t = N₀ x e^-Kt hoặc N_t = N₀x 10^-kt (1)

Giả sử N₀ = 106, N_t = 102 và t = 10, từ phương trình (1) có thể tính được k như sau:

Trong đó k= K/2,303 gọi là hằng số bất hoạt vi sinh vật.

Phương trình (1) cho thấy số lượng vi sinh vật N giảm theo hàm số mũ và phụ thuộc vào thời gian tiệt khuẩn t. Ngược lại, có thể hiệu thời gian tiệt khuẩn cần thiết để giảm số lượng vi sinh vật đến một giá trị bất kỳ cho trước là hàm số của số lượng vi sinh vật ban đầu. Khái niệm này cho thấy sự cân thiết phải giảm số lượng vi sinh vật ban đầu có trong sản phẩm trước khi tiệt khuẩn xuống mức thấp nhất có thể.

Việc xác định tốc độ bất hoạt cung cấp phương tiện để so sánh sức đề kháng của cùng một loại vi sinh vật ở các nhiệt độ khác nhau hoặc so sánh sức đề kháng của các vi sinh vật khác nhau đối với cùng một tác nhân tiệt khuẩn, ví dụ nhiệt, bức xạ hay tác nhân hóa chất. Tốc độ bất hoạt cũng có thể được dùng như một thước đo định lượng sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như pH, tính thẩm thấu và sự có mặt các chất hóa học đến quá trình tiệt khuẩn.

Vì có cùng một tỉ lệ vi sinh vật chết sau mỗi phút, theo lý thuyết, số lượng vi sinh vật sống sót không thể đạt tới giá trị 0. Do đó, luôn có khả năng còn vi sinh vật sống tồn tại trong sản phẩm sau khi tiệt khuẩn với một xác suất nhất định. Từ hình 7.1 suy ra nếu thòi gian tiệt khuẩn 30 phút sẽ đảm bảo rằng xác suất để 1 vi sinh vật sống sót là 10^-6. Hoặc nếu tính theo đơn vị đóng gói thì có nghĩa là 1 trong 10⁶ đơn vị sản phẩm còn bị nhiễm vi sinh vật.

Theo mô hình toán học trên, xác suất sống sót của các vi sinh vật sau quá trình tiệt khuẩn có thể là rất nhỏ nhưng không bao giờ là số không, và tỉ lệ vi sinh vật sống sót sau chu trình tiệt khuẩn phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật nhiêm ban đầu (N₀), vào mức độ đề kháng của các loài vi sinh vật (trị số D) và vào những yếu tố môi trường diễn ra trong quá trình tiệt khuẩn.

Vì thế, mức độ vô khuẩn của sản phẩm không phải là một giá trị tuyệt đối mà chỉ là xác suất của một mức đảm bảo vô khuẩn được qui định trước nhằm đáp ứng nhu cầu và mục tiêu sử dụng của sản phẩm. Khái niệm vô khuẩn tuyệt đối được thay thế bằng khái niệm mức đảm bảo vô khuẩn (Sterility Assurance Level, SAL).

Mức bảo đảm vô khuẩn của một qui trình tiệt khuẩn là xác suất vi sinh vật còn sống sót trong một đơn vị sản phẩm đã tiệt khuẩn, hoặc là xác suất tồn tại một đơn vị đóng gói không vô khuẩn trong toàn bộ lô sản phẩm sau khi tiệt khuẩn bằng qui trình đó.

Đối với một qui trình tiệt khuẩn đã cho, SAL phụ thuộc số lượng vi sinh vật có trong sản phẩm trước khi tiệt khuẩn, sức đề kháng của nó với tác nhân tiệt khuẩn và môi trường trong đó vi sinh vật tồn tại trong quá trình xử lý. Khi có thể, nên sử dụng mức bảo đảm vô khuẩn SAL để đánh giá hiệu quả tiệt khuẩn của các phương pháp tiệt khuẩn. SAL của mỗi qui trình tiệt khuẩn được thiết lập trong khi thẩm định qui trình.

Giá trị SAL được đưa ra dựa trên bản chất của sản phẩm và phản ứng tương hợp sinh học giữa sản phẩm với cơ thể con người khi sử dụng. Mức đảm bảo vô khuẩn thường được qui định bởi nhà sản xuất sản phẩm hoặc các cơ quan Y tê có thẩm quyền. Ví dụ:

• Đối với sản phẩm khi sử dụng có tiếp xúc trực tiếp với vết thương hay hệ thống tuần hoàn, hệ thống miễn dịch của cơ thể thì SAL của các sản phẩm này phải đạt 10^-6, nghĩa là trong 1 triệu sản phẩm đã tiệt khuẩn chỉ cho phép 1 sản phẩm có thể chưa vô khuẩn.
• Đối với các sản phẩm chỉ tiếp xúc ngoài da, hoặc ở ông tiêu hoá thì SAL được yêu cầu phải đạt 10^-3, nghĩa là chỉ cho phép 1/1000 sản phẩm có thể chưa vô khuẩn.
• Một số sản phẩm chỉ yêu cầu bất hoạt các vi sinh vật gây bệnh và giảm tổng lượng vi sinh vật hiếu khí tới mức nhất định là đạt tiêu chuẩn vệ sinh, thì SAL chỉ yêu cầu đạt 10^-2 đến 10^-3. SAL trong trường hợp này thường áp dụng trong tiệt khuẩn nhằm bảo quản thực phẩm, nguyên liệu dược phẩm và các dược liệu.

2.4. Trị số giảm thập phân D

Trong phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt, tại một nhiệt độ tiệt khuẩn nhất định, khi thời gian tiệt khuẩn tăng lên thì số lượng vi sinh vật sống sót giảm đi (so với số lượng ban đầu). Mối quan hệ đó được biểu thị bằng trị so D.

Đối với quá trình tiệt khuẩn bằng nhiệt hoặc hóa chất, trị số D là thời gian tiệt khuẩn cần thiết để diệt hết 90% số lượng vi sinh vật sống trong một mẫu ở một nhiệt độ nhất định. Nói cách khác, D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 1 đơn vị logarit.

Theo số học, trị số D là nghịch đảo của hằng số bất hoạt và có thể tính được từ phương trình (1):

N_t = N₀ x 10^-kt (1)

Để N_t = 0,1 N₀ thì N_t = D = k^-1

Suy ra N_t = N₀ x 10^-t/D

D= t/(logN₀ – logN_t )

Ví dụ, sau 5 phút tiệt khuẩn ở 121°C, số lượng vi sinh vật giảm từ 2xl0⁵ còn 6xl0³ . Trị số D ở 121°C là:

N₁₂₁ = 5 phút/ [log ( 2xl0⁵) – log ( 6xl0³)]= 3,28 phút

Như vậy, ở 121°C số lượng vi sinh vật giảm 90% sau mỗi 3,28 phút.

Về mặt hình học, trị số D là thòi gian để đường sống sót vi sinh vật đi qua một chu kỳ logarit, ví dụ từ 102 giảm còn 101.

Trị số D đặc trưng cho tính đề kháng của vi sinh vật ở nhiệt độ xử lý. Trị số D càng lớn, vi sinh vật càng “bền” với nhiệt, ở nhiệt độ 121°C, trị số D của vi sinh vật phổ biến trong khoảng 0,2 đến 1,5 phút.

Rõ ràng, hiệu quả của quá trình tiệt khuẩn có thể rất khác nhau phụ thuộc vào trị số D của loài vi sinh vật bị nhiễm (hoặc phụ thuộc vào trị số D lớn nhất trong trường hợp nhiễm nhiều loại vi sinh vật). Hình 7.2 cho thấy ở 121°C, nếu D = 0,5 phút, thời gian tiệt khuẩn để giảm số lượng vi sinh vật từ 10² đến mức 10^-6 là 4 phút. Nếu D = 1 phút, thời gian tiệt khuẩn tăng lên 8 phút.

Đối với quá trình tiệt khuẩn bằng chiếu xạ, trị số D là liều xạ cần thiết để diệt hết 90% số lượng vi sinh vật sống trong một mẫu.

2.5. Hệ số phá hủy nhiệt Z

Trị số D sẽ giảm đi khi nhiệt độ tiệt khuẩn tăng lên. Khoảng nhiệt độ tăng thêm cần thiết để D giảm 10 lần được biểu thị bằng hệ số Z.

Z= ( T₂ – T₁) /(log D₁ – log D₂) (3)

D_i là trị số D của vi sinh vật ở nhiệt độ T_i)

Hệ số Z là đại lượng thể hiện sự đề kháng của vi sinh vật đối với sự thay đổi nhiệt độ. Hệ số Z cũng là thước đo khả năng đề kháng tương đối của các vi sinh vật khác nhau. Hầu hết vi sinh vật không bào tử có hệ số z trong khoảng 4-6°C, trong khi các bào tử có từ 10-15°C. Bảng 7.2 thể hiện trị số D và Z của một số vi sinh vật.

Hệ số Z còn là đại lượng thể hiện sự thay đổi hằng số bất hoạt khi nhiệt độ thay đổi. Thực tế cho thấy trong phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm, khi nhiệt độ thay đổi 1°C sẽ dẫn đến trị số D thay đổi khoảng 26%. Các giá trị này chỉ ra sự ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của một quá trình tiệt khuẩn khi giá trị nhiệt độ tiệt khuẩn thực tế thấp hơn mức nhiệt độ quy định.

Hình 7.2. Trị số S và Z của một số vi sinh vật

Vi sinh vật	D121 (phút)	Z(°C)
Clostridium botulinum	0,2	10
Geobacillus stearothermophilus	2,0	6
Bacillus subtilis	0,5	10
Bacillus megaterium	0,04	7
Clostridium sporogenes	0,8- 1,4	13
Clostridium histolyticum	0,01	10

2.6. Giá trị tiệt khuẩn F₀

Với mỗi loại vi sinh vật có giá trị Z nhất định, quá trình tiệt khuẩn bằng nhiệt cần một tổ hợp thông số nhiệt độ và thời gian xử lý để đảm bảo hiệu quả tiệt khuẩn. Khi nhiệt độ tăng lên, thòi gian xử lý được giảm đi và ngược lại. Mối quan hệ nghịch đảo đó được biểu thị bằng giá trị tiệt khuẩn F0, còn gọi là thòi gian tiệt khuẩn tương đương ở 121°C.

Giá trị F₀ của một chu trình tiệt khuẩn bằng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ và thời gian nhất định là thời gian tiệt khuẩn ở 121 °C cần thiết để tạo ra hiệu quả tiệt khuẩn tương đương, áp dụng cho một loại vi sinh vật tham chiếu (có Z= 10°C).F₀ có thể tính được từ công thức:

F₀= t. 10^(T-121)/Z(phút) (4)

Trong đó: T là nhiệt độ tiệt khuẩn trong khoảng thời gian t; Z = 10°C.

Quan hệ giữa F₀ và D thể hiện ở công thức:

F₀= D₁₂₁(logN₀-logN_t) (5)

Ví dụ: một quá trình tiệt khuẩn kéo dài trong 15 phút ở 121°C, từ công thức (4) ta có:

F₀= 15. 10^(121-121)/10 = 15 (phút)

Nếu thực hiện quá trình tiệt khuẩn trong thời gian 15 phút ở 111°C, ta có:

F₀ = 15. 10^(111-121)/10 = 1,5 (phút)

Nghĩa là quá trình tiệt khuẩn ở 111°C trong 15 phút cho hiệu quả tương đương với 1,5 phút ở 121°C.

Tương tự, nếu thực hiện quá trình tiệt khuẩn trong thời gian 15 nhút ở 124°C, ta có:

F₀ = 15. 10^(124-121)/10 = 29 (phút)

Thực tế trong một chu trình tiệt khuẩn, cả giai đoạn gia nhiệt và làm lạnh đều có đóng góp vào tổng tỉ lệ bất hoạt vi sinh vật của quá trình. Nếu chia một chu trình tiệt khuẩn thành nhiều phân đoạn thời gian/nhiệt độ thì F₀ tổng sẽ bằng tổng các giá trị F₀ của mỗi phân đoạn. Độ chính xác của giá tri F₀ ước tính phụ thuộc vào độ dài của mỗi phân đoạn. Ở hình 7.3, độ dài mỗi phân đoạn là 1 phút. Như vậy, có thể thay việc kiểm soát một chu trình tiệt khuẩn dựa trên thời gian và nhiệt độ tiệt khuẩn bằng việc kiểm soát dựa trên giá trị F₀.

Dược điển Anh khuyến cáo việc dùng F₀ để thẩm định điều kiện tiệt khuẩn các chế phẩm nước bằng phương pháp nhiệt ẩm. Khi đó, tổng F₀ tối thiểu là 8.

Với các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt, giá trị F0 có thể dưới 8. Trường hợp này, cần thẩm định và kiểm soát liên tục, chặt chẽ các chỉ số vi sinh trong quá trình tiệt khuẩn để đảm bảo không quá 1 vi sinh vật sống tồn tại trong 106 đơn vị sản phẩm sau tiệt khuẩn.

Ngoài ý nghĩa đánh giá hiệu quả tiệt khuẩn ở các giai đoạn khác nhau trong một chu trình tiệt khuẩn bằng nhiệt, F₀ còn dùng để đánh giá hiệu quả tiệt khuẩn của các sản phẩm ở những vị trí nguội nhất trong buồng tiệt khuẩn, qua đó xác định được thời gian tiệt khuẩn thích hợp, đảm bảo toàn bộ lô sản phẩm đạt được độ vô khuẩn cần thiết.

Các yếu tố ảnh hưởng đến giá trị F₀ hao gồm:

– Đặc tính của bao bì: kích thước, hình dạng và hệ số truyền nhiệt.

– Thể tích và độ nhớt của sản phẩm.

– Kích thước và hình dạng của khối sản phẩm xếp trong buồng tiệt khuẩn.

Các phương trình tính giá trị F₀ nêu trên có thể áp dụng cho quá trình tiệt khuẩn bằng nhiệt khô. Nhiệt độ tham chiếu trong trường hợp này là 170°C. Giá trị Z thường là 22°C đối với bào tử vi khuẩn và là 54°C đối với nội độc tố.

3. Các phương pháp tiệt khuẩn

Các phương pháp mô tả dưới đây chủ yếu dùng để diệt hoặc loại bỏ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc ra khỏi sản phẩm cần tiệt khuẩn. Đối với các sản phẩm sinh học có nguồn gốc từ người hay động vật, trong quá trình thẩm định phải chứng minh khả năng loại bỏ hay làm bất hoạt virus của qui trình tiệt khuẩn.

Nếu có thể, nên ưu tiên chọn phương pháp tiệt khuẩn thành phẩm. Nếu không thể tiệt khuẩn thành phẩm được, có thể loại vi khuẩn bằng phương pháp lọc qua màng lọc giữ lại vi khuẩn hay phương pháp sản xuất vô khuẩn. Trong mọi trường hợp, vật chứa và nút đậy phải có khả năng duy trì được tính vô khuẩn của sản phẩm cho đến khi hết hạn dùng.

Số lượng vi sinh vật trong sản phẩm trước khi tiệt khuẩn cần được khống chế bằng cách áp dụng qui trình sản xuất và biện pháp phòng ngừa thích hợp để sau khi tiệt khuẩn có thể đạt được mức bảo đảm vô khuẩn SAL là 10⁶ hay nhỏ hơn.

3.1. Tiệt khuẩn bằng nhiệt

Tiệt khuẩn bằng nhiệt là phương pháp tiệt khuẩn phổ biến nhất. Có hai phương pháp tiệt khuẩn dùng nhiệt thường được áp dụng là: phương pháp tiệt khuẩn dùng nhiệt khô (sử dụng tủ sấy) và tiệt khuẩn dùng nhiệt ẩm (dùng nồi hấp). Mỗi phương pháp phù hợp với một số loại sản phẩm khác nhau. Ví dụ các loại bột và các chất béo chỉ có thể tiệt khuẩn bằng nhiệt khô; các dung dịch nước có thể được tiệt khuẩn bằng nồi hấp. Dụng cụ kim loại hoặc thuỷ tinh có thể được tiệt khuẩn bằng cả hai cách.

3.1.1. Sự phá hủy vi sinh vật bởi nhiệt

Khả năng tiêu diệt vi sinh vật bởi nhiệt là hàm số của tổ hợp thời gian- nhiệt độ. Nếu nhiệt độ tăng lên, thời gian cần thiết để đạt mức đảm bảo vô khuẩn cho trước giảm đi. Các thành phần sống của vi sinh vật như protein và acid nucleic bị bất hoạt với tốc độ tăng nhanh khi nhiệt độ tăng trên 50°C. Cơ chế gây chết bởi nhiệt có thể do sự bất hoạt các hệ enzym sống trong tế bào. Cơ chế tác dụng của nhiệt ẩm và nhiệt khô có khác nhau. Nhiệt ẩm gây chết vi sinh vật do làm đông tụ các phân tử protein trong tế bào sống, trong khi nhiệt khô làm biến tính protein bởi quá trình oxy hóa. Bảng 7.3 cho thấy nhiệt độ gây đông tụ protein tỷ lệ nghịch với độ ẩm của môi trường.

Bảng 7.3. ảnh hưởng của độ ẩm đến nhiệt độ gây đông tụ protein trứng

Hàm ẩm (%)	Nhiệt độ gây đông tụ (°C)
50	50
20	85
6	145
0	170

Như vậy, vi sinh vật chịu được nhiệt khô tốt hơn nhiệt ẩm. Ví dụ bào tử Bacillus subtilis var. niger có thể chịu được nhiệt khô ở 121°C lâu hơn gần 2000 lần so với nhiệt ẩm cũng ở 121°C. Trong khi nhiệt ẩm chỉ chứa nhiệt lượng nhiều hơn khoảng 7 lần so với nhiệt khô ở cùng nhiệt độ.

Nói chung, vi khuẩn sinh bào tử đề kháng nhiệt tốt hơn vi khuẩn không sinh bào tử, vi khuẩn Gram dương đề kháng nhiệt tốt hơn vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn dạng cầu đề kháng nhiệt tốt hơn vi khuẩn dạng que.

Bào tử của vi khuẩn ưa nhiệt có sức đề kháng mạnh nhất. Ví dụ bào tử của Desulfotomaculum nigrificans có giá trị D₁₂₁ trên 10 phút. Các prion có sức đề kháng đặc biệt cao với nhiệt. Prion gây bệnh xốp não ở bò có động học bất hoạt không theo quy luật số mũ và đề kháng được với hầu hết quá trình tiệt khuẩn bằng nhiệt thông thường.

Ngoài ra, số lượng vi sinh vật trong một quần thể càng nhiều thì tính đề kháng nhiệt của chúng càng cao. Cơ chế về tính đề kháng nhiệt của một số lượng lớn vi sinh vật là do chúng tiết ra các chất có tác dụng bảo vệ.

Cơ chế đề kháng của bào tử với nhiệt đến nay chưa thực sự được sáng tỏ. Một số đặc điểm của bào tử có liên quan đến khả năng kháng nhiệt như: chứa hàm lượng nước thấp, sự khoáng hóa, vỏ có cấu trúc nhiều lốp…

Bào tử chứa một lượng calci dipicolinat liên kết với protein thành phức chất có tính ổn định cao với nhiệt và sự thay đổi môi trường. Bào tử còn chứa các protein acid hòa tan phân tử nhỏ, các protein này liên kết chặt chẽ vói ADN, giúp chống lại tia uv và các hóa chất gây tổn hại ADN.

Hàm lượng nước trong bào tử có liên quan đến khả năng đề kháng. Bào tử chứa hàm lượng nước thấp và được điều hòa bởi lớp vỏ chủ yếu theo cơ chế thấm thấu. Làm mất nước các bào tử mối nảy mầm, bằng cách ngâm vào dung dịch đậm đặc saccharose hoặc natri clorid, khả năng đề kháng với nhiệt được khôi phục. Giả thuyết khác cho rằng thành phần peptidoglycan trong cấu trúc lớp vỏ đóng vai trò duy trì hàm lượng nước thấp trong bào tử.

Khi bào tử nảy mầm, cấu trúc peptidoglycan bị phá vỡ, bào tử trở nên nhạy cảm với nhiệt.

3.1.2. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Vi sinh vật có sức đề kháng khác nhau đối với nhiệt ẩm. Đa số vi khuẩn không bào tử, dạng sinh dưỡng của nấm men và nấm mốc bị phá hủy ở nhiệt đô 50-60°C. Nhiều virus bị tiêu diệt ở nhiệt độ 55-60°C. Để diệt virus nhạy cẩm nhiệt và thể sinh dưỡng của vi khuẩn có thể dùng hơi nước ở nhiệt độ 73°C trong thời gian tối thiểu 10 phút. Nước sôi có thể diệt được vi khuẩn không bào tử, nấm, virus và một số bào tử thông thường.

3.1.2.1. Nguyên tắc tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm được tiến hành trong một thiết bị chuyên dùng gọi là nồi hấp (autoclave). Tác nhân tiệt khuẩn là hơi nước bão hòa dưới áp suất cao. Đây là phương pháp ưu tiên lựa chọn khi có thể, nhất là đối với các dung dịch nước và đồ vải.

Điều kiện chuẩn của phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm là ở 121°C (đạt được dưới áp suất 2 bar) trong ít nhất 15 phút đối với các thành phẩm là dung dịch nước. Có thể tiến hành tiệt khuẩn ở điều kiện nhiệt độ và thời gian khác với điều kiện chuẩn nhưng cần chứng minh hiệu quả của chế độ tiệt khuẩn đã chọn. Các điều kiện tiệt khuẩn khác được khuyên cáo như trong bảng 7.4.

Bảng 7.4. Một số chế độ tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Nhiệt độ (°C)	Áp suất danh định tương ứng (bar)	Thời gian tiệt khuẩn tối thiểu (phút)
115	1.7	30
121	2,0	15
126	2,4	10
134	3,0	3

3.1.2.2. Hơi nước bão hòa dưới áp suất cao

Áp suất bản thân nó không có khả năng diệt khuẩn. Hơi nước được dùng dưới áp suất cao là cách để đạt được nhiệt độ cao. cần dùng hơi nước đúng chất lượng để tránh những vấn đề liên quan đến việc loại bỏ không khí trong nôi hấp, vấn đề hơi nước quá nhiệt và khả năng thấm hơi nước vào vật xốp.

Có hai cách để thu được hơi nước, ở quy mô nhỏ, hơi nước có thể được tạo ra từ nước bên trong nồi hấp. Vì có mặt nước nên hơi nước thu được gọi là hơi nước bão hòa ẩm. Hơi nước ẩm chứa ít nhiệt hơn hơi bão hòa khô. Ở quy mô lớn, hơi nước bão hòa khô có thể được cung cấp từ một nồi hơi riêng biệt

Hơi nước được gọi là bão hòa khi nó ở nhiệt độ sôi (nhiệt độ bão hòa) ứng với một áp suất nhất định.

Đường phân cách pha lỏng-hơi (còn gọi đường hơi bão hòa, hình 7.4) thu được bằng cách nối các điểm nhiệt độ bão hòa ở các áp suất khác nhau, ví dụ 115°C/l,7 bar, 121°C/2 bar và 134°C/3 bar. Nếu hơi nước bão hòa ở điểm A được tách ra khỏi nước, thì được gọi là hơi nước bão hòa khô. Tiếp tục cung cấp nhiệt đẳng áp từ A đến D, nhiệt độ và thể tích riêng của nó lại tiếp tục tăng lên. Hơi nước ở nhiệt độ này gọi là hơi nước quá nhiệt. Hiệu số nhiệt độ của hơi quá nhiệt và hơi bão hoà được gọi là độ quá nhiệt. Một cách khác để đạt được trạng thái hơi quá nhiệt là giảm áp suất đẳng nhiệt, ví dụ từ A đến E.

Hơi nước quá nhiệt nóng hơn hơi nước bão hòa khô tại cùng một áp suất, nhưng giải phóng ra nhiệt chậm hơn, hiệu quả tiệt khuẩn kém hơn. Hơi nước có độ quá nhiệt càng cao, nó càng gần giống với khí nóng. Nói chung, độ quá nhiệt tối đa cho phép thường không quá 5°C.

Trong thực tế, hiện tượng quá nhiệt có thể xuất hiện trong thiết bị tiệt khuẩn có áo nhiệt, khi nhiệt độ lớp áo cao hơn nhiệt độ buồng tiệt khuẩn. Để tránh hiện tượng này, cần duy trì nhiệt độ lớp áo gần tương đương với nhiệt độ trong buồng tiệt khuẩn.

Hơi nước tại bất cứ điểm nào trên đường phân cách pha đều có cùng nhiệt độ với nước sôi tại cùng điểm đó, nhưng chứa hàm lượng nhiệt lớn hơn. Hơi nước bão hòa tại điểm A, nếu làm lạnh ở áp suất không đổi (A đến B) hoặc tăng áp suất ở nhiệt độ không đổi (A đến C), nước sẽ tách ra. Sự ngưng tụ của hơi nước bão hòa khi làm lạnh sẽ giải phóng tức thời toàn bộ nhiệt ẩn chứa trong nó. Đặc điểm này rất quan trọng đối với quá trình tiệt khuẩn.

Báng 7.5. Hàm lượng nhiệt của hơi nước ở các nhiệt độ khác nhau

Áp suất (bar)	Nhiệt độ (°C)	Nhiệt cảm (kj/kg)	Nhiệt ẩn (kJ/kg)	Nhiêt ẩn so với tổng (%)
1,7	115	483	2216	82
2,0	121	505	2202	81
2,4	126	530	2185	80
3,0	134	561	2164	79

Nhiệt năng trong hơi nước tồn tại dưới dạng nhiệt cảm và nhiệt ẩn. Nhiệt cảm là nhiệt cần thiết để tăng nhiệt độ của nước, còn nhiệt ẩn là lượng nhiệt cần để chuyển nước thành hơi tại điểm sôi của nó. Bảng 7.5 cho thấy nhiệt ẩn luôn chiếm tỉ lệ cao cho dù ở các nhiệt độ khác nhau.

Các ưu điểm của hơi nước bão hòa bao gồm:

• Tính thấm tốt: Hơi nước di chuyển nhanh tới các vật và khuếch tán vào các lỗ xốp của vật. Thể tích hơi nước giảm mạnh khi ngưng tụ, tạo ra một vùng áp suất thấp, giúp cho hơi nước tiếp tục khuếch tán vào một cách dễ dàng.
• Làm nóng nhanh: Hơi nước làm nóng vật rất nhanh do có lượng nhiệt ẩn lớn.
• Nhiệt ẩm: Nước ngưng tụ đóng vai trò là tác nhân gây chết vi sinh vật do làm đông tụ
• Không độc: sản phẩm không bị nhiễm chất độc sau tiệt khuẩn.

3.1.2.3. Ảnh hưởng của sự có mặt của không khí trong buồng tiệt khuẩn

Không khí chiếm chỗ trong buồng tiệt khuẩn trước khi hơi nước được tạo ra hoặc dẫn vào. Không khí cũng hòa tan trong nước trước khi nước được chuyển thành hơi. Chúng sẽ bám vào các bề mặt của vật thành lớp màng mỏng. Vì không khí là chất dẫn nhiệt kém, nên nó tạo ra một lớp hàng rào ngăn cản nhiệt dẫn truyền vào vật. Sự có mặt của không khí trong các vật xốp, ví dụ đồ vải, sẽ cản trở sự thấm hơi nước, làm giảm hiệu quả của quá trình tiệt khuẩn.

Ở các nồi hấp nhỏ, chuyển động xáo trộn mạnh của hơi nước có thể phá vỡ lớp màng không khí, nhưng ở các thiết bị lớn, cần thiết phải loại không khí khỏi buồng tiệt khuẩn.

3.1.2.4. Cấu tạo và vận hành nồi hấp tiệt khuẩn

Nồi hấp nhỏ

Các thiết bị này dùng ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc sản xuất nhỏ. Chúng thường có hai kiểu: kiểu kiểm soát áp suất hoặc kiểm soát nhiệt độ.

Trong thiết bị kiểm soát áp suất, đồng hồ áp suất là chỉ thị duy nhất cho biết điều kiện bên trong buồng hấp. Do vậy, không khí phải được loại ra ở giai đoạn đầu quá trình tiệt khuẩn.

Ở thiết bị kiểm soát nhiệt độ (hình 7.5), một nhiệt kế hoặc rơle nhiệt được dùng để hiển thị hoặc duy trì nhiệt độ tiệt khuẩn, và do vậy không nhất thiết phải có giai đoạn đuổi không khí.

Nồi hấp công nghiệp:

Các bộ phận thiết yếu của một thiết bị tiệt khuẩn công nghiệp được nêu trong hình 7.6. Hơi nước được tạo ra từ một nồi hơi riêng biệt và được dẫn vào buồng tiệt khuẩn. Buồng tiệt khuẩn có thêm lớp áo bảo ôn, được nối với máy hút chân không và bộ lọc khí vô khuẩn. Ngoài các nhiệt kế và áp kế của lớp áo và buồng tiệt khuẩn, thiết bị còn được kết nối với máy ghi nhiệt độ và áp suất để lưu lại các thông số của quá trình tiệt khuẩn.

Các bước vận hành nồi hấp được mô tả tóm tắt như sau:

– Nạp sản phẩm:

Sản phẩm cần tiệt khuẩn được xếp vào nồi hấp sao cho nhiệt có thể phân bố đều. Để kiểm soát sự phân bố nhiệt đều đặn tới các sản phẩm, có thể sử dụng chỉ thị nhiệt dán vào một số sản phẩm đặt rải rác trong khoang thiết bị. Sau đó, đóng kín cửa nồi hấp.

A. Áp kế tổng; B. Bộ phận tách nước ngưng; c. Van giảm, D. Cấp hơi lớp áo; E. Cấp hơi buồng tiệt khuẩn; F. Lọc khí; G. Áp kế lóp áo; H. Áp kế buồng tiệt khuẩn; I. Thông khí lớp áo; J. Bơm chân không; K. Đường xả lớp áo; L. Đường xả buồng tiệt khuẩn; M. Hốc nhiệt kế; N. Nhiệt kế trực tiếp; O. Máy ghi nhiệt độ; P. Bộ lọc; Q. Van 1 chiều; R. Van ổn định nhiệt độ- áp suất; S. Van tràn; U. Đệm kín nước.

– Loại không khí, nạp hơi nước:

Nạp hơi nước từ phía trên đồng thời mở van xả L phía dưới, không khí sẽ được đẩy ra khỏi nồi hấp, đến khi thấy hơi nước đi ra thì đóng van lại. Cách thực hiện khác là hút chân không đến 25 mbar để loại không khí trước khi dẫn hơi nước vào. Cách này hiệu quả trong trường hợp sản phẩm có cấu trúc xốp, giúp hơi nước dễ thấm sâu.

Để giảm hàm ẩm của hơi nước tạo ra từ nồi hơi, hơi nước được dẫn qua một bộ phận phân ly B để giữ lại nước ngưng tụ phân tán trong hơi nước. Điều chỉnh van c để áp suất giảm đến mức quy định, qua đó hơi nước được làm khô.

– Duy trì nhiệt độ:

Duy trì áp suất hơi tương ứng với nhiệt độ tiệt khuẩn trong thời gian qui định. Trong quá trình tiệt khuẩn, cần theo dõi và ghi chép lại nhiệt độ và áp suất bên trong nồi hấp. Nhiệt độ thường được theo dõi bằng các đầu dò nhiệt đặt ở phần nguội nhất của nồi hấp. Thông số vận hành của mỗi chu trình tiệt khuẩn được ghi lại dưới dạng biểu đồ nhiệt độ – thời gian.

Trong quá trình tiệt khuẩn, một lượng lớn nước ngưng được tạo ra, nhất là ở giai đoạn gia nhiệt. Nước ngưng sẽ chảy xuống đáy buồng tiệt khuẩn và được dẫn ra qua ống xả L. Bộ phận này được lắp van một chiều và ống xi-phông để tránh hiệt tượng hút ngược nước vào buồng khi làm lạnh.

– Giai đoạn hạ nhiệt độ:

Khóa van để ngừng cấp hơi nước, sau đó để nguội đến khoảng 70-80°C trước khi lấy sản phẩm ra khỏi thiết bị. Với các nồi hấp lớn hoặc sản phẩm lâu nguội do có nhiệt dung lớn (chất lỏng), để rút ngắn thời gian làm nguội, có thể dùng một trong các biện pháp sau tùy theo từng loại sản phẩm.

+ Làm khô và làm nguội sản phẩm bằng cách hút chân không, áp dụng thích hợp khi tiệt khuẩn các vật xốp. Chân không làm nước bay hơi nhanh nên làm khô nhanh đồng thời giảm nhanh nhiệt độ. Một bơm chân không được dùng để loại hơi nước và giảm áp suất đến 25 mbar trong khoảng 3 phút. Ở điều kiện này, hàm ẩm của các đồ bằng vải có thể giảm đến mức gần như trước khi tiệt khuẩn.

+ Làm nguội bằng cách bơm tuần hoàn nước mát trong các khoang trao đổi nhiệt thiết kế sẵn trong nồi hấp, áp dụng cho các loại sản phẩm không đóng kín nút (môi trường nuôi cấy).

+ Làm nguội bằng cách phun trực tiếp nước mát lên sản phẩm (dạng phun sương), áp dụng để làm nguội các sản phẩm được hàn kín như ông tiêm.

Trong quá trình tiệt khuẩn, có giai đoạn áp suất của khí trong và ngoài bao bì sản phẩm chênh lệch cao, có thể làm biến dạng hoặc nứt vỡ bao bì (nhất là bao bì bằng nhựa). Để cân bằng áp suất trong và ngoài bao bì, cần phải sử dụng các thiết bị hấp có bù áp lực, giúp cho áp lực trong nồi luôn cân bằng với áp lực bên trong sản phẩm ở mọi giai đoạn, đặc biệt trong quá trình làm nguội.

3.1.2.5. ứng dụng

Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm thường được áp dụng với các sản phẩm:

• Dung dịch và hỗn dịch nước: thường tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 121°C/15 phút, tương đương với F0 lớn hơn 8.
• Chất béo và dầu (nếu không dùng được nhiệt khô): 121°C/2 giờ.
• Đồ vải: 134°C/3-5 phút.
• Bao bì nhựa và nút cao su.
• Dụng cụ kim loại (cần làm khô ngay để tránh ăn mòn).
• Dụng cụ và bao bì thủy tinh (khi không dùng được nhiệt khô, ví dụ khi kèm theo nút cao su).

3.1.2.6. Ưu nhược điểm

Ưu điểm:

• Nhiệt lượng cao, truyền nhiệt nhanh và đều.
• Diệt khuẩn hiệu quả hơn nhiệt khô, nên cần nhiệt độ và thòi gian xử lý ngắn hơn.
• Có thể áp dụng cho nhiều dạng bào chế: thuốc tiêm, dung dịch nhỏ mắt và nhiều dạng thuốc nước.
• Thấm nhanh vào các vật liệu xốp, rất thích hợp để tiệt khuẩn đồ vải và các dụng cụ phẫu thuật.
• Thích hợp với bao bì bằng nhựa và một số dạng bào chế đặc biệt khác.
• Dễ kiểm soát quá trình một cách chính xác.
• Không để lại tạp chất độc hại.

Nhược điểm:

• Không thích hợp với nguyên liệu khan nước như dạng bột và dâu.
• Không dùng được với các chất nhạy cảm với nhiệt.
• Không phá hủy được chí nhiệt tố.
• Thiết bị cần chịu áp lực.
• Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

3.1.3. Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

Tiệt khuẩn được thực hiện trong tủ sấy. Điều kiện 100°C trong 90 phút có thể diệt được dạng sinh dưỡng của vi sinh vật, nhưng cần 140°C trong 3 giờ để có thể diệt được các bào tử đề kháng. Bào tử nấm mốc có sức đề kháng trung bình, bị bất hoạt ở 115°C trong 90 phút. Hầu hết virus có sức đề kháng tương tự dạng sinh dưỡng của vi khuẩn, nhưng một số virus (ví dụ virus viêm gan B) có sức đề kháng như bào tử.

Điều kiện chuẩn của phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt khô là sấy ở nhiệt độ 160°C trong ít nhất 2 giờ. Các chế độ tiệt khuẩn khác được khuyến cáo như trong bảng 7.6.

Bảng 7.6. Một số chế độ tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

Nhiệt độ(°C)	Thời gian tiệt khuẩn tối thiểu (phút)
180	30
170	60
160	120

Tiệt khuẩn và khử chất gây sốt trên các bao bì, dụng cụ thủy tinh cần tiến hành ở nhiệt độ cao hơn 220°C, thường dùng chế độ 250°C trong 45 phút. Trong trường hợp này, để đánh giá quá trình tiệt khuẩn, có thể thay chỉ thị sinh học bằng nội độc tố vi khuẩn bền nhiệt.

3.1.3.1. Cấu tạo và vận hành tủ sấy tiệt khuẩn

Tủ sấy tiệt khuẩn thường có thiết bị đối lưu không khí để đảm bảo sự phân phối nhiệt đồng đều trong toàn bộ buồng tiệt khuẩn. Khí cấp vào tủ cần qua bộ lọc vi khuẩn. Áp suất trong tủ sấy thường là áp suất dương. Nhiệt truyền đến vật chủ yếu theo hình thức đối lưu, bức xạ và một phần nhỏ theo cơ chế dẫn truyền. Thực tế truyền nhiệt đối lưu là quá trình kém hiệu quả nên việc đối lưu khí tốt còn giúp sử dụng tối đa nhiệt lượng của khí nóng do làm tăng sự tiếp xúc của các phân tử không khí với vật sấy và với bề mặt nóng của khoang sấy. Hơn nữa, đối lưu khí còn giúp loại trừ các vùng khí mát ứ đọng. Bức xạ cũng là dạng chủ yếu của truyền nhiệt nên các nguồn nhiệt cần được đặt rải rác xung quanh buồng tiệt khuẩn. Thời gian làm nóng vật đạt đến nhiệt độ quy định cần giảm đến mức tối thiểu, một phần để tiết kiệm nhiệt năng, nhưng chủ yếu để tránh hiện tượng quá nhiệt ở các vùng ngoài của sản phẩm trong thời gian nhiệt thấm vào phía trong. Cách tốt nhất là dùng các bao bì nhỏ để nhiệt có thể truyền nhanh vào trong. Thông thường, sản phẩm bột hoặc dầu được đóng thành gói nhỏ không quá 25 g. Tốt nhất là xử lý cùng một loại sản phẩm đựng trong bao bì đồng nhất về hình dạng và kích thước. Bao bì cần dẫn nhiệt và càng mỏng càng tốt. Ví dụ với thuốc bột thì bao bì kim loại thích hợp hơn thủy tinh. Bên ngoài bao bì cần có màu tối hoặc mờ để hấp thụ nhiệt tốt và hạn chế phản xạ nhiệt. Nói chung, các bao bì cần thiết kế cao và hẹp (hình trụ dài) hoặc nông và rộng ((ha Petri) để nhiệt có thể thấm nhanh theo một hướng.

Vì dụng cụ, sản phẩm tiệt khuẩn bằng nhiệt khô thường không được dùng ngay nên cần lưu ý đồ bao gói để đảm bảo vô khuẩn đến khi được dùng.

Ví dụ pipet thủy tinh cần phải vô khuẩn cả bên trong và ngoài, nên cần được gói kín hoàn toàn bằng giấy hoặc đựng trong ông bằng carton, kim loại hoặc thủy tinh. Bình thủy tinh chỉ cần bảo vệ phần miệng bình bằng nắp kim loại. Bao bì chứa sản phẩm cần tiệt khuẩn được bịt kín bằng nắp vặn với lớp đệm thích hợp.

Khi xếp sản phẩm lên giá trong tủ sấy, cần lưu ý các vấn đề sau:

• Sản phẩm được xếp cách nhau và cách thành buồng sấy để khí lưu thông, để nhiệt bức xạ từ vách buồng sấy đến sản phẩm.
• Tránh xếp nhiều sản phẩm nhỏ thành gói lớn hoặc xếp nhiều sản phẩm trong một hộp lốn. Ví dụ đĩa Petri chỉ nên xếp 2 hoặc 3 đĩa vào một gói.
• Nắp vặn cần nới lỏng để tránh biến dạng, nứt hoặc nổ vỡ, rồi vặn chặt lại sau khi tiệt khuẩn.

Sau khi xếp sản phẩm vào tủ sấy, nhiệt độ được tăng dần đến mức yêu cầu và duy trì trong thòi gian quy định. Sau đó, tắt nguồn nhiệt và vẫn để tủ đóng kín đến khi nhiệt độ hạ thấp đến khoảng 40°C. Sau đó, sản phẩm được lấy ra.

Trong nhà máy sản xuất qui mô lớn, hoặc trong các dây chuyền sản xuất thuốc tiêm thế hệ mới, quá trình tiệt khuẩn dùng nhiệt khô là một quá trình liên tục, được thực hiện trong một lò ngang dùng bức xạ hồng ngoại. Sản phẩm hên tục di chuyển qua nguồn nhiệt bức xạ nhờ một băng chuyền. Tốc độ di chuyển được điều chỉnh để sản phẩm được tiếp xúc với nhiệt trong thời gian quy định. Tủ sấy băng chuyền hồng ngoại cho hiệu suất truyền nhiệt cao, thời gian làm nóng nhanh, nhiệt độ ổn định và hầu như không bị ảnh hưởng bởi lớp màng không khí.

3.1.3.2. Ứng dụng

• Tiệt khuẩn đồ thủy tinh. Trước khi tiệt khuẩn, đồ thủy tinh được rửa sạch bằng nước không chứa chất gây sốt.
• Tiệt khuẩn dụng cụ bằng gốm hoặc kim loại.
• Tiệt khuẩn dầu và chất béo, kể cả thuốc tiêm dầu.
• Tiệt khuẩn các chất dạng bột, kể cả các sản phẩm tự nhiên có thể có chứa chất gây sốt (bột talc, natri clorid).

3.1.3.3. Ưu nhược điểm

Ưu điểm:

• Thiết bị và quá trình vận hành đơn giản.
• Không làm ướt nguyên vật liệu được tiệt khuẩn, dùng được cho các dạng bột, dầu.
• ít ảnh hưởng đến đồ thủy tinh và kim loại hơn nhiệt ẩm (trừ các vật sắc nhọn).
• Có thể phá hủy được chí nhiệt tố.
• Không để lại tạp chất độc hại.

Nhược điểm:

• Nhiệt lượng thấp hơn, truyền nhiệt kém và khó đều hơn so với nhiệt ẩm, nên cần nhiệt độ cao hơn và thời gian dài hơn.
• Chỉ áp dụng được với các sản phẩm bền với nhiệt độ cao, không dùng được với đồ cao su, nhựa, đồ vải và hầu hết các thuốc.
• Không dùng được cho dung dịch nước.
• Các thông số quy trình khó kiểm soát chính xác.
• Quá trình nâng nhiệt độ có thể làm các vi sinh vật, bào tử khô hơn nên sức đề kháng nhiệt của chúng tăng lên. Vì vậy, để tiêu diệt chúng cần tác động nhiệt độ cao và thòi gian dài hơn.

3.2. Tiệt khuẩn bằng chất khí

Những năm gần đây, ngành Y Dược phát triển mạnh, nhiều phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh cùng với các thiết bị y học mới được sử dụng. Thầy thuốc ngày càng dùng nhiều thiết bị phức tạp và mỏng manh hơn, ví dụ các dụng cụ bằng nhựa và các thiết bị vi phẫu thuật nhạy cảm với nhiệt và ẩm. Do vậy, các phương pháp tiệt khuẩn và khử khuẩn bằng vật lý, hóa lý hoặc hóa học cũng cần thay đổi.

Một trong những xu hướng thay thế cho phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt là dùng các chất khí tiệt khuẩn ở nhiệt độ thấp. Trong số các tác nhân khí dùng tiệt khuẩn, ethylen oxyd được dùng phổ biến nhất ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, những năm gần đây, nguy cơ về độc tính, chi phí và những quy định về môi trường ngày càng nghiêm ngặt dẫn đến việc sử dụng chất này cần phải cân nhắc. Các lựa chọn khác là formaldehyd, hydroperoxyd peracetic acid, ozon và clor dioxyd.

Một chất khí tiệt khuẩn lý tưởng cần có nhiều đặc điểm như dưới đây. Nhưng thực tế không có tác nhân nào có đủ những đặc điểm đó.

– Hiệu quả cao: diệt được vi khuẩn, trực khuẩn lao, virus, nấm và bào tử.

– Tác dụng nhanh: có khả năng diệt khuẩn nhanh ở dưới 65°C.

– Không mất hoạt tính khi tiếp xúc với các chất hữu cơ.

– Khả năng thấm tốt: thấm qua được các bao bì và các khoảng trống của thiết bị.

– Tương hợp với nhiều loại sản phẩm và vật liệu, không làm biến đổi tính chất và chức năng sau nhiều lần tiệt khuẩn.

– Không độc hoặc có phương pháp phòng tránh cho người dùng, không tồn dư trong sản phẩm và không tạo ra sản phẩm phụ có độc.

– Không gây ô nhiễm môi trường.

– Dễ kiểm soát bằng các phương pháp vật lý, hóa học và sinh học.

– Dễ sử dụng.

– Chi phí thấp.

Khí tiệt khuẩn được phân loại thành 2 nhóm theo cơ chế tác dụng: tác nhân alkyl hóa và tác nhân oxy hóa. Các chất khí tác dụng theo cơ chế alkyl hóa có khả năng phản ứng cao và tác động với nhiều loại tế bào. Có nhiều vị trí cho quá trình alkyl hóa, như các nhóm amino, sulphydryl và hydroxyl ở các protein hoặc base purin của các acid nucleic. Tác nhân alkyl hóa thông dụng nhất là ethylen oxyd và formaldehyd. Bên cạnh đó p-propiolacton, methylbromid và propylen oxyd cũng có thể được sử dụng.

Các chất khí tác dụng theo cơ chế oxy hóa cũng là những tác nhân tiệt khuẩn mạnh, ví dụ các hợp chất clor (clor dioxyd) hoặc hợp chất peroxyd như ozon, hydroperoxyd và acid peracetic.

3.2.1. Tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd

Ethylen oxyd (epoxyethan, oxyran, dimethylen oxyd, oxacyclopropan, 1,2-epoxy ethan) là ether vòng đơn giản nhất với công thức C₂H₄0. Ở nhiệt độ phòng, ethylen oxyd là chất khí không màu, mùi ether đặc trưng. Sôi ở 10,8°C. Đây là khí duy nhất được dùng ở quy mô công nghiệp.

Ưu điểm chính của ethylen oxyd là tính khuếch tán tốt và không ảnh hưởng đến nhiều loại vật liệu. Do vậy, có thể dùng tiệt khuẩn sản phẩm đã đóng gói hoàn chỉnh. Nhược điểm của ethylen oxyd là độc, dễ cháy, và khi dùng cần kiểm soát độ ẩm của hỗn hợp ethylen oxyd – không khí. Hơn nữa, dùng ethylen oxyd đăt tiền hơn tiệt khuân bằng nhiệt. Sản phẩm sau tiệt khuân cân được thông khí tôt để loại hết ethylen oxyd. Tính dễ cháy có thể khăc phục băng cách phôi hợp ethylen oxyd với các khí trơ như nitơ, carbon dioxyd.

3.2.1.1.Hoạt tính diệt khuẩn

Ethylen oxyd co tác dụng với tất cả các vi sinh vật (vi khuẩn nấm virus) và bào tử. Để diệt dạng bào tử, nồng độ ethylen oxyd cằn cao hơn từ 5-10 lần so với dạng sinh dưỡng. Trong khi với các chất diệt khuẩn dạng lỏng chênh lệch nồng độ cần thiết để diệt dạng bào tử và dạng sinh dưỡng là khoảng 1000 lần. Bacillus subtilis var. niger là một trong những bào tử đề kháng mạnh nhất với ethylen oxyd, nên được dùng làm chỉ thị sinh học để kiểm soát và thẩm định các chu trình tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd. Ethylen oxyd không làm bất hoạt các prion.

Về cơ chế tác dụng, các nhóm amino, sulphydryl và hydroxyl trong phân tử protein bị alkyl hóa bởi ethylen oxyd tạo ra các sản phẩm hydroxyethyl:

R-OH + C₂H₄0 R-0-CH₂-CH₂-0H

R-SH + C₂H₄0 -> R-S-CH₂-CH₂-OH

R-COOH + C₂H₄0 -> R-COO-CH₂-CH₂-OH

R-nh₂ + c₂h₄o -> R-NH-CH₂-CH₂-OH

Các phản ứng này làm biến tính protein, enzym và acid nucleic, dẫn đến biến đổi chuyển hóa và làm chết vi sinh vật.

3.2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tiệt khuẩn

Alkyl hóa là phản ứng hóa học theo động học bậc một, nước là xúc tác không thể thiếu để thúc đẩy sự mở vòng của ethylen oxyd. Do vậy, mức độ hydrat hóa của vi khuẩn đóng vai trò quan trọng đối với tác dụng của ethylen oxyd. ở nhiệt độ không đổi, tốc độ bất hoạt tỉ lệ với nồng độ ethylen oxyd trong khoảng nồng độ 400-1600 mg/L. Cũng như hơi nước bão hòa, tác dụng bất hoạt vi sinh vật của ethylen oxyd tuân theo hàm số mũ, nên có thể mô tả sức đề kháng của vi sinh vật với ethylen oxyd bằng thời gian giảm thập phân (trị số D). Trị số D của bào tử Bacillus subtilis var. niger là 2,7 phút ở 50°C. Cũng giông các quá trình hóa học, tốc độ diệt khuẩn bằng ethylen oxyd tăng khoảng gấp đôi khi nhiệt độ tăng thêm 10°C.

– Độ ẩm môi trường tiệt khuẩn:

Độ ẩm không khí của môi trường tiệt khuẩn là thông số quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả tiệt khuẩn của ethylen oxyd. Độ ẩm tương đối tối ưu là 35% ở 25°C. Nhưng thực tế có thể cần độ ẩm cao hơn vì quá trình tiệt khuẩn thường tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng. Nếu độ ẩm của sản phẩm đạt được sự cân bằng với độ ẩm tương đối của môi trường ở nhiệt độ phòng, nhưng sau đó nhiệt độ tăng lên trong quá trình tiệt khuẩn, sẽ làm thiếu hụt hơi ẩm trên bề mặt các vi khuẩn. Sự thiếu hụt ẩm ở các vị trí tác dụng cũng có thể xảy ra nếu sản phẩm được đóng gói trong các bao bì chống ẩm. Khi đó độ ẩm tối ưu chỉ đạt được ở môi trường bên ngoài bao bì. Trường hợp này, độ ẩm của môi trường cần cao hơn 35%, khoảng 40-80%, để hơi ẩm có thể khuếch tán qua lớp bao bì và để sản phẩm có thể hấp thụ thêm ẩm.

Hơi ẩm cũng cần thiết ở giai đoạn tiền chân không trong chu trình tiệt khuẩn. Vì khi hút chân không, các bào tử có thể bị khô thêm, dẫn đến làm tăng sức đề kháng đối với tác dụng của ethylen oxyd.

– Nhiệt độ tiệt khuẩn:

Nhiệt độ tiệt khuẩn thông thường trong khoảng 40-50°C. Quá trình có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng nhưng thòi gian kéo dài. Vì ethylen oxyd thường chỉ dùng đối với các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt, nên nhiệt độ tiệt khuẩn thường không vượt quá 60°C.

– Nồng độ và thời gian:

Thông thường, nồng độ ethylen oxyd được biểu thị theo đơn vị mg/L, vì tốc độ tiệt khuẩn phụ thuộc vào áp suất riêng phần của ethylen oxyd trong môi trường buồng tiệt khuẩn. Nồng độ sử dụng phô biến trong khoảng 250- 1000 mg/L. Nếu nồng độ tăng lên gấp đôi, thòi gian tiệt khuẩn có thể giảm đi một nửa. Những nồng độ quá cao ít khi được dùng vì khó loại triệt để ethylen oxyd ra khỏi sản phẩm. Với hầu hết các sản phẩm thông thường, chế độ tiệt khuẩn khuyến cáo là 850-900 mg/L trong 3 giờ, hoặc 450 mg/L trong 5 giờ ở nhiệt độ 54°C.

3.2.1.3. Khả năng thấm của ethylen oxyd

Ethylen oxyd có khả năng thấm qua giấy, vải, một số loại nhựa và cao su. Do vậy, cần chọn loại bao bì thích hợp để đóng gói sản phẩm. Ngoài ra, bao bì cũng cần làm sạch vì các tạp chất hữu cơ có thể cản trỏ sự thấm và làm giảm tác dụng của ethylen oxyd.

Ethylen oxyd cũng được hấp thụ mạnh bởi nhiều chất khác nhau. Do vậy, sản phẩm sau tiệt khuẩn cần phải được loại ethylen oxyd. Cách đơn giản nhất là để sản phẩm thoáng khí một thời gian trong một phòng được thông khí tốt. Cách nữa là ngay sau khi tiệt khuẩn, buồng tiệt khuẩn được hút chân không sâu (15 mbar) trong khoảng 2 giờ. Cách thứ ba là hút chân không một phần (200 mbar) rồi nạp không khí vô khuẩn vào đến áp suất thường. Lặp lại quá trình hút chân không – nạp không khí như vậy 5-6 lần.

3.2.1.4. Cấu tạo và vận hành thiết bị tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd

Cấu tạo

Các bộ phận chính của thiết bị gồm có:

• Một buồng tiệt khuẩn kín khí, chịu được chân không và áp suất cao.
• Bộ phận đun nóng, ví dụ áo hơi xung quanh buồng, ở một số thiết bị, sản phẩm tiệt khuẩn được làm nóng và làm ẩm bằng hơi nước bão hòa phun trực tiếp vào buồng tiệt khuẩn.
• Một tấm chặn hỗn hợp khí, thường ở dưới đáy buồng. Tấm chặn có tác dụng ngăn cản ethylen oxyd lỏng tiếp xúc với sản phẩm. Ethylen oxyd lỏng có thể gây hại cho một số đồ nhựa.
• Bộ phận làm bốc hơi hoàn toàn hỗn hợp khí và làm nóng tối nhiệt độ tiệt khuẩn.
• Bơm hút chân không hiệu suất cao, để loại không khí trước và hút hỗn hợp khí sau tiệt khuẩn.
• Bộ phận cung cấp nước tạo độ ẩm.
• Bộ phận tạo và dẫn không khí vô khuẩn vào khoang tiệt khuẩn ở cuối giai đoạn tiệt khuẩn.

Cấc bước vận hành:

• Nạp sản phẩm cần tiệt khuẩn vào buồng tiệt khuẩn.
• Nạp một lượng nước vào buồng tiệt khuẩn để tránh hiện tượng vi sinh vật mất nước do chân không. Thời gian tiệt khuẩn giảm đáng kể nếu sản phẩm được làm ẩm trước khi nạp khí ethylen oxyd. Nếu khí và ẩm được nạp đông thòi, thời gian tiệt khuẩn sẽ kéo dài.
• Đóng kín cửa buồng tiệt khuẩn và tăng nhiệt độ đến mức yêu cầu. cần đảm bảo đúng mức nhiệt độ và đồng nhất trong toàn bộ khối sản phẩm trước khi nạp khí ethylen oxyd. Làm nóng bằng cách sục hơi nước sẽ tăng nhiệt độ nhanh và đều, nhưng làm nóng bằng áo hơi hoặc bộ phận đun nóng từ bên ngoài sẽ lâu hơn.
• Tăng nhiệt độ ở bộ phận trao đổi nhiệt tối khoảng 100°C, vì nhiệt độ khí ethylen oxyd giảm mạnh khi thoát ra khỏi bình chứa.
• Giảm áp suất buồng tiệt khuẩn đến 15 mbar. ở quy mô nhỏ, có thể dùng khí ethylen oxyd để thay thế không khí, nhưng cách này lãng phí và không tin cậy với các thiết bị công nghiệp.
• Nạp thêm nước để tạo độ ẩm yêu cầu (nếu cần).
• Hỗn hợp khí đã làm ấm được dẫn vào buồng tiệt khuẩn đến áp suất quy định và duy trì trong thời gian quy định.
• Giải hấp thụ khí ethylen oxyd.

3.2.1.4. Kiểm soát quá trình

Trong quá trình tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd cần theo dõi các thông số bằng các phương pháp vật lý, hóa học, sinh học tương tự phương pháp tiệt khuẩn bằng hơi nước. Nhiệt độ và áp suất cần được theo dõi và ghi lại dưới dạng biểu đồ trong suốt chu trình tiệt khuẩn, sản phẩm tiệt khuẩn cuối cùng cần được lấy mẫu để kiểm tra độ vô khuẩn.

Tuy nhiên, các phương pháp vật lý và hóa học dùng các thiết bị thông thường không cung cấp đủ thông tin đảm bảo mỗi đơn vị trong toàn bộ sản phẩm đã được tiếp xúc với khí ethylen oxyd ở nồng độ và độ ẩm quy định. Do đó, phương pháp tin cậy là dùng chỉ thị sinh học. Đặt các chỉ thị sinh học chứa 10⁶ bào tử Bacillus subtilis var. niger rải rác vào một số vị trí trong buồng tiệt khuẩn, cùng với sản phẩm tiệt khuẩn. Sau chu trình tiệt khuẩn, các chỉ thị này được lấy ra và kiểm tra độ vô khuẩn.

3.2.1.5. Ứng dụng

• Phương pháp thích hợp để tiệt khuẩn dược liệu và các sản phẩm dạng bột.

• Phương pháp cũng thích hợp với các đồ bằng nhựa, cao su, kim loại và một số vật liệu khác.

Một số loại nhựa có thể nhạy cảm với ethylen oxyd. Bề mặt nhựa polystyren có thể bị rạn nứt nếu tiệt khuẩn bằng hỗn hợp ethylen oxyd/Arcton, nhưng không bị ảnh hưởng nếu dùng hỗn hợp ethylen oxyđ/carbon dioxyd hoặc ethylen oxyd nguyên chất. Cao su bền với ethylen oxyd hơn so với hơi nước. Trong mọi trường hợp, cần tránh tiếp xúc với ethylen oxyd lỏng.

3.2.1.6. Độc tính

Tiếp xúc với hơi ethylen oxyd có thể xảy ra các phản ứng dị ứng, đau đầu, chóng mặt, nôn, kích ứng mắt và niêm mạc hô hấp. Nồng độ cao có thể gây ho và khó thở nặng, ức chế thần kinh trung ương, thậm chí phá hủy hệ thần kinh. Ở dạng lỏng, ethylen oxyd có thể gây bỏng da. Tiếp xúc với ethylen oxyd kéo dài có thể dẫn đến chứng đục thủy tinh thể, bệnh đa dây thần kinh, giảm trí nhớ và ung thư.

3.2.1.7. Ưu nhược điểm

Ưu điểm:

• Thích hợp với các chất nhạy cảm nhiệt vì quá trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng hoặc hơi cao hơn nhiệt độ phòng.
• Không phá hủy các chất và thiết bị nhạy cảm hơi ẩm vì quá trình chỉ yêu cầu độ ẩm thấp. Tuy nhiên, trường hợp này cần tránh việc làm ẩm bằng hơi nước vì nhất thời có thể tạo ra độ ẩm cao.
• Ethylen oxyd có khả năng thấm tốt qua nhiều loại bao bì.
• Mặc dù ethylen oxyd là chất có khả năng phản ứng cao nhưng thực tế có rất ít chất bị phá hủy trong quá trình tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd.

Nhược điểm:

• Quá trình kéo dài. Thời gian tiếp xúc và giải hấp kéo dài. Do vậy, phương pháp không thích hợp trong trường hợp khẩn cấp hoặc các thiết bị đắt tiền cần dùng liên tục.
• Tiệt khuẩn quy mô nhỏ có thể chỉ cần các thiết bị đơn giản, nhưng quy mô công nghiệp yêu cầu thiết bị tinh vi, đắt tiền, cần bảo trì đều đặn và yêu cầu người dùng có kỹ năng.
• Chi phí vận hành cao.
• Nguy cơ về độc tính và tính dễ cháy yêu cầu sự thận trọng đặc biệt.
• Các chất độc hại như ethylen clohydrin có thể được tạo ra nếu vật liệu chứa ion clorid tự do, ví dụ PVC. Vì lượng ion clorid tăng lên khi PVC tiếp xúc với bức xạ ion hóa, nên cần tránh việc tái tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd với các sản phẩm bằng PVC trước đó đã tiệt khuẩn bằng phương pháp chiếu xạ.

3.2.1.8. Bàn luận

Tiệt khuẩn bằng ethylen oxyd đắt hơn và kém tin cậy hơn phương pháp dùng hơi nước. Do vậy không nên dùng phương pháp này nếu sản phẩm có thể tiệt khuẩn được bằng hơi nước. Để tăng độ tin cậy của phương pháp, cần làm giảm số lượng vi sinh vật nhiễm ban đầu đến mức tối thiếu.

3.2.2. Tiệt khuẩn bằng formaldehyd

Formaldehyd cũng là tác nhân alkyl hóa nhưng không thông dụng bằng ethylen oxyd khi dùng làm tác nhân tiệt khuẩn. Lý do là formaldehyd có khả năng thẩm thấu kém và dễ bị bất hoạt bởi các chất hữu cơ. Hơn nữa, nồng độ cao của formaldehyd khó duy trì trong không khí vì nó dễ lắng đọng dưới dạng polymer rắn khi tiếp xúc với các bề mặt có nhiệt độ thấp. Formaldehyd có thể dùng để xông hơi tủ dòng khí vô trùng (laminar) và phòng sản xuất để loại vi sinh vật trên bề mặt. Formaldehyd có thể kết hợp với hơi nước ở nhiệt độ thấp để tiệt khuẩn các chất nhạy cảm với nhiệt.

Do không thể bảo quản được ở nhiệt độ thường nên formaldehyd thường được dùng dưới 2 dạng: dạng dung dịch formaldehyd 37% (Formalin, BP) có thêm chất ổn định tránh kết tủa dạng polymer rắn, hoặc dạng viên nén paraformaldehyd. Khí formaldehyd tạo ra từ các nguồn này khi được đun nóng hoặc khi thêm kali permanganat.

3.2.2.1. Tính chất của form aIdehyd

Formaldehyd, còn gọi aldehyd formic, là phân tử nhỏ có công thức CH₂0, khối lượng phân tử 30,03. Sôi ở -19,1°C. Formaldehyd có thể tồn tại ở cả 3 dạng: khí, lỏng và rắn.

Ở điều kiện khô, formaldehyd tồn tại dạng monomer là chất khí không màu, mùi hắc mạnh. Khí này ổn định ở nhiệt độ cao trên 80°C hoặc ở nhiệt độ phòng nếu nồng độ thấp dưới 1,75 mg/L. ở nhiệt độ phòng nhưng nồng độ cao hơn, nó polymer hóa thành polyoxymethylen (anhydrid polymer, (CH₂0)n) hoặc paraformaldehyd (polymer hydrat HO(CH₂O)_nH) dạng màng mỏng.

Formaldehyd rất dễ tan trong nước tạo ra dạng hydrat, nên dễ được loại khỏi phòng sau chu trình tiệt khuẩn. Nó cũng dễ tan trong ethanol và diethyl ether nhưng không tan tronghydrocarbon. Trong dung dịch nước, formaldehyd ổn định đến nồng độ 35% và tự polymer hóa ở nồng độ cao hơn.

Khí formaldehyd dễ cháy và nổ khi trộn với không khí ở nồng độ trên 7% v/v. Tuy nhiên, nồng độ tiệt khuẩn thường sử dụng thấp hơn nhiều so với nồng độ có thể gây cháy nổ.

3.2.2.2. Hoạt tính diệt khuẩn

Phổ tác dụng của formaldehyd rất rộng, diệt được vi khuẩn, nấm và virus. Nó cũng có hoạt tính trên côn trùng và một số động vật sống khác. Dạng bào tử có sức đề kháng với formaldehyd cao hơn dạng sinh dưỡng 2 -15 lần.

3.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiệt khuẩn

Formaldehyd được dùng chủ yếu để tiệt khuẩn bề mặt do khả năng thấm sâu kém ethylen oxyd. Tác dụng của formaldehyd phụ thuộc vào bản chất vi sinh vật (vi khuẩn, virus, nấm, kí sinh trùng). Tác dụng còn phụ thuộc thời gian tiếp xúc, bản chất sản phẩm cần tiệt khuẩn và các yếu tố khác: nhiệt độ, độ ẩm và nồng độ formaldehyd.

– Nhiệt độ:

Nhiệt độ là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến tác dụng tiệt khuẩn của khí formaldehyd. Khả năng tiệt khuẩn tăng khi tăng nhiệt độ đến 70-80°C. Nhiệt độ cần tối thiểu 18°C. Trong thực tế thường thực hiện ở 2 chế độ: 80°C để có chu trình nhanh, hoặc 55-56°C với sản phẩm nhạy cảm nhiệt.

– Độ ẩm không khí:

Độ ẩm không khí cũng là yếu tố quan trọng. Độ ẩm luôn phải trên 50% và tối ưu là 80-90%. Ngoài ra, cần tránh hiện tượng ngưng tụ hơi nước.

– Nồng độ:

Hiệu quả tiệt khuẩn tăng theo nồng độ formaldehyd. Nồng độ khí formaldehyd thường dùng trong khoảng 6-50 mg/L, thông thường là 20 mg/L. Trong buông kín, nồng độ formaldehyd giảm với tốc độ trung bình 2 mg/L/giờ.

– Chân không:

Chân không giúp chất khí thấm sâu vào vật liệu. Chân không cũng làm thay đôi áp suất hơi, làm tăng nồng độ formaldehyd trong pha khí Chân không thường dùng trong khoảng 5-50 mbar.

3.2.2.4. Độc tính

Formaldehyd gây độc khi thâm nhập vào đường hô hấp, đường tiêu hóa hoặc tiếp xúc với da. Formaldehyd gây kích ứng mắt, mũi, họng ngay ở nồng độ vài phần triệu, gây hoại tử ở nồng độ cao hoặc tiếp xúc kéo dài. Hít phải hơi formaldehyd có thể dẫn đến ung thư.

3.2.2.5. Ưu nhược điểm

Formaldehyd có ưu điểm so với ethylen oxyd là dễ được phát hiện dù ở nồng độ thấp (0,2-0,6 ppm) và ít có nguy cơ cháy nổ. Hơn nữa, formaldehyd rẻ hơn ethylen oxyd và dễ giải hấp.

Formaldehyd không có khả năng thấm sâu nên chỉ dùng tiệt khuẩn bề mặt. Hơn nữa, formaldehyd cũng kém hiệu quả khi tiệt khuẩn các vật xốp do đặc điểm dễ tạo màng polymer, ngăn cản nó tiếp tục thấm sâu. Formaldehyd gây ăn mòn rất mạnh trên một số vật liệu. Formaldehyd không dùng để tiệt khuẩn các sản phẩm làm từ cellulose. Chu trình tiệt khuẩn bằng formaldehyd thường kéo dài, tối thiểu 4 giờ.

3.2.3. Tiệt khuẩn bằng ozon

Từ đầu thế kỷ 20, dung dịch nước ozon đã được sử dụng phổ biến để tẩy trắng bột giấy, xử lý nước thải, khử trùng nước bể bơi hoặc nước nuôi trồng thủy sản, tiệt khuẩn nước khoáng đóng chai, bảo quản trái cây, thực phẩm. Trong y học, nước ozon được dùng ngoài để xử lý vết thương, mụn nhọt, súc miệng chữa viêm răng miệng, dùng uống chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, cúm, viêm họng. Tuy vậy, công nghệ sử dụng ozon dạng khí gần đây mới được nghiên cứu và bắt đầu phát triển. Với các ưu điểm hiệu quả cao, kinh tế, an toàn và thân thiện môi trường, tiệt khuẩn bằng ozon tỏ ra là công nghệ rất có triển vọng.

3.2.3.1. Tính chất của ozon

Ozon là dạng thù hình 3 nguyên tử của oxy. ở nồng độ loãng, ozon có mùi dễ chịu, cho cảm giác sạch sẽ. Ở nồng độ cao, ozon có màu xanh đậm và gây kích ứng mạnh.

Ozon nặng hơn không khí 1,657 lần, sôi ở -112°C, hóa rắn ở -192°C. Độ tan của ozon trong nước giảm mạnh khi nhiệt độ tăng, từ 1,4g/L ở 0°C nhưng hoàn toàn không tan khi nhiệt độ trên 70°C.

Ozon kém ổn định ở điều kiện thường. Thòi gian bán hủy là 4 phút trong dung dịch nước và 14 giò trong không khí ở 20°C.

Công thức hóa học của ozon thường được viết dưới dạng 0₃, trong đó nguyên tử oxy thứ 3 quay quanh cấu trúc 2 nguyên tử oxy còn lại. Nghĩa là nguyên tử oxy thứ ba liên kết với 2 nguyên tử oxy còn lại bằng một cầu nối lỏng lẻo. Do vậy, ozon có tính phản ứng rất cao. Điều đó cũng giải thích cho tính chất dễ bị phân hủy của ozon và dễ tái hợp lại thành các phân tử 0₂ bền vững hơn:

2O₃ -> 2O₂ + 2O -> 3O₂

Sự tái hợp ozon thành oxy phân tử xảy ra nhanh hơn khi nhiệt độ tăng, ở 300°C, ozon chuyển hoàn toàn thành O₂ với mọi nồng độ. Sự tái hợp cũng xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn nếu có mặt các chất xúc tác như platin, palladi, silicon và nhiều chất hữu cơ hoặc vô cơ khác. Trong không khí, tốc độ tái hợp cũng rất nhanh do hoạt tính oxy hóa mạnh của ozon khi tiếp xúc với các thành phần của không khí. Do sản phẩm tái hợp là oxy phân tử không độc, nên không cần phải để sản phẩm thoáng khí kéo dài sau khi tiệt khuẩn bằng ozon.

3.2.3.2. Sản xuất ozon

Ozon không thể bảo quản được dưới dạng lỏng do có nhiệt độ hóa lỏng rất thấp, quá trình phân hủy ozon tỏa nhiệt mạnh và thòi gian bán hủy rất ngắn ở áp suất cao. Do vậy, ozon phải được tạo ra ngay trưốc khi dùng. Có thể thu được ozon với nồng độ thấp bằng cách chiếu tia UV, nhưng kỹ thuật chủ yếu để tạo ra ozon là dùng ống phóng điện hoặc buồng plasma lạnh.

Ống phóng điện (corona discharge): Không khí được bơm qua ống phóng điện thủy tinh bên ngoài là anod, bên trong là cathod, ở giữa là lớp cách điện thường bằng thủy tinh. Điện thế sử dụng thường rất cao (7-30 kV) với tần số 0,8 đến 2kHz. ống sẽ phóng dòng điện này qua lớp không khí và tương tác với oxy trong không khí để tạo ra ozon. Phương pháp này đơn giản, kinh tế, cho ozon nồng độ cao đến 120mg/L.

Buồng plasma lạnh: Plasma được tạo thành bởi điện trường mạnh với hỗn hợp các ion dương, ion âm mật độ rất cao, kích thích oxy biến đổi thành khí ozon và tập hợp khí O₄, O₅, O₆… Phương pháp này tạo ra ozon sạch và nồng độ cao đến 200 mg/L.

3.2.3.3. Hoạt tính diệt khuẩn

Ozon diệt được vi khuẩn, nấm, amip, bào tử và virus. Ozon còn có thể làm bất hoạt các prion. Tính oxy hóa mạnh của ozon làm biến đổi các thành phần hóa học của tế bào. Các thành phần tế bào có thể bị oxy hóa trực tiếp bởi ozon, đặc biệt là ở vị trí các liên kết đôi trong phân tử. Cơ chế tiệt khuẩn chủ yêu là sự tạo thành các gốc tự do (O*, OH*) khi ozon phân hủy. pha khí và độ ẩm thấp, gốc O* được tạo thành. Nếu có mặt nước, phản ứng của gốc O với nước tạo ra gốc OH* có hoạt tính oxy hóa mạnh hơn. Cơ chế này cũng giải thích cho tác dụng hiệp đồng diệt virus của ozon và hydroperoxyd ở pha khí và trong dung dịch.

Đặc điểm quan trọng nhất làm hạn chế hoạt tính của ozon là sự tái hợp thành oxy phân tử, dẫn đến giảm số lượng các gốc tự do tạo thành. Quá trình này được xúc tác bởi các chất hữu cơ. Khi ozon thấm qua lớp bao bì bằng giấy hoặc polyethylen, hiện tượng tái hợp xảy ra, làm giảm tác dụng tiệt khuẩn đối với các sản phẩm chứa bên trong bao bì. Do vậy, mặc dù ozon có tính thấm tốt do kích thưóc phân tử nhỏ, nhưng ozon chỉ được coi là tác nhân tiệt khuẩn bề mặt.

Ozon có thể gây ăn mòn các hợp kim chứa sắt, đồng, kẽm, niken. Nó cũng làm hỏng các vật liệu bằng cao su, vải sợi và polystyren, nhưng không ảnh hưởng đến các vật liệu silicon, polycarbonat và polyvinyl clorid loại cứng.

Ngưỡng gây độc của ozon là khoảng 0,4 ppm. Trong khi con người có thể ngửi thấy mùi ozon ở nồng độ 0,02 đến 0,04 ppm. Nghĩa là ozon có thể được phát hiện ở nồng độ thấp hơn mức gây độc 10 lần. Tính chất này là ưu điểm so với ethylen oxyd. Hầu hết các nước quy định ngưỡng nồng độ tiếp xúc tối đa là 0,1 đến 0,2ppm. ở nồng độ cao hơn, ozon có thể gây kích ứng mắt và đường hô hấp.

3.2.3.4. Ưu điểm

• Chi phí thấp hơn phương pháp tiệt khuẩn dùng ethylen oxyd.
• Không độc: sản phẩm phân hủy chỉ có nước và oxy, an toàn cho người vận hành và thân thiện với môi trường.
• Sản phẩm sau tiệt khuẩn có thể dùng được

3.2.3.5. Ứng dụng

Dùng tiệt khuẩn các bao bì, dụng cụ bằng polyvinyl clorid loại cứng, nylon, polyethylen, polypropylen, silicon, thép không rỉ, thủy tinh…

3.3. Tiệt khuẩn bằng tia bức xạ (radiation)

Các bức xạ có thể chia thành 2 nhóm theo bản chất: sóng điện từ (tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia X và tia gamma) và dòng hạt vật chất (bức xạ alpha và beta). Bức xạ còn được phân loại theo năng lượng (tần số) cao hay thấp. Bức xạ tần số thấp còn gọi là bức xạ không ion hóa (như ánh sáng mặt tròi, tia uv năng lượng thấp, tia hồng ngoại, sóng radio…) do không có đủ năng lượng cắt đứt các liên kết hóa học, không tạo ra các ion có hoạt tính cao. Bức xạ ion hóa (tia X, tia alpha, beta, gamma) là bức xạ có năng lượng lớn, có thể cắt đứt các liên kết hóa học, đánh bật các điện tử ra khỏi các nguyên tử, tạo ra các ion có hoạt tính cao.

3.3.1. Bức xạ tử ngoại (UV)

Tia UV bước sóng trong khoảng 220-280 nm có tác dụng diệt vi sinh vật hiệu quả. Các tia có bước sóng 265 nm hoặc gần 265 nm có hiệu quả tiệt khuẩn cao nhất do được hấp thụ mạnh bởi các nucleoprotein.

Phương pháp chủ yếu để tạo ra tia uv dùng tiệt khuẩn là cho dòng điện qua hơi thủy ngân trong một Ống chân không làm bằng thủy tinh borosilicat.

Bức xạ UV với cường độ từ 10-60pW/mm² có thể làm giảm 90% số lượng vi sinh vật trong một thời gian ngắn. Tế bào sinh dưỡng và bào tử đều nhạy cảm với tia ƯV. Khả năng đề kháng của vi sinh vật với tia UV tăng theo thứ tự: vi khuẩn < nấm men < bào tử vi khuẩn < bào tử nấm mốc. So với vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương cần liều xạ cao gấp 2 lần, bào tử vi khuẩn cần liều gấp 5-10 lần, trong khi các bào tử nấm mốc, nhất là loài có màu sẫm (ví dụ Aspegillus niger) có sức đề kháng đặc biệt, cần liều cao hơn từ 20 đến 100 lần.

Nhược điểm lớn của tia tử ngoại trong tiệt khuẩn là khả năng xuyên sâu kém do bị hấp thụ mạnh bởi nhiều loại cơ chất. Bụi bám trên bề mặt sản phẩm cũng làm giảm hiệu quả của tia UV. Trong điều kiện thực tế, tia UV thường chỉ làm giảm số lượng vi sinh vật trong khoảng 2-3 log và hầu như không có tác dụng trên bào tử nấm mốc. Do vậy, ứng dụng của tia UV bị giới hạn trong tiệt khuẩn không khí và nước ở dạng lớp mỏng, hoặc các bề mặt không thấm.

Bảng 7.7. Khả năng thấm của tia UV

Cơ chất	Khoảng cách tia UV thấm qua (cm)
Không khí	300-500
Nước	30
Dịch hoa quả	0,1
Sữa lỏng	0,01
Thủy tinh	<0,1
Nhựa trong	<0,01

3.3.2. Bức xạ ion hóa

Bức xạ ion hóa là những bức xạ năng lượng cao phát ra từ các đồng vị phóng xạ như cobalt-60 (tia gamma) hoặc từ máy gia tốc electron (chùm tia điện tử, tia X). Tia gamma có ưu điểm là tiệt khuẩn với độ tin cậy rất cao nhưng nhược điểm là nguồn bức xạ (nguyên liệu phóng xạ) tương đối đắt tiền và quá trình phóng xạ xảy ra liên tục, không điều khiển tắt được như nguồn electron gia tốc. Nguồn electron gia tốc còn có ưu điểm là suất liều cao và đồng nhất.

Bức xạ ion hóa đi qua môi trường vật chất, làm cho môi trường đó ion hóa trực tiếp hay ion hóa gián tiếp và làm thay đổi cấu trúc hóa học của các đối tượng vật chất trong môi trường đó, có thể gây đột biến trong phân tử DNA, gây tổn thương trên tế bào, vi khuẩn, virus…

3.3.2.1. Tia gamma

Tia gamma là sóng điện từ có bước sóng cực ngắn (A, < 0,001 nm), đi được khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên thấu cao vào vật chất. Tia gamma ở mức năng lượng trung bình có thể xuyên qua tấm chì dày 5 cm hay tấm nhôm dày 2 m. Chất đồng vị được sử dụng làm nguồn phóng xạ quyết định khả năng đâm xuyên của bức xạ phát ra. Khi tia gamma đi vào vật chất, cường độ của nó giảm dần. Các vật liệu đặc như chì, bê tông là vật liệu chắn được tia gamma.

Hoạt độ các nguồn phóng xạ đều bị giảm theo thời gian do hiện tượng tự nhiên gọi là tự phân hủy. Chu kỳ bán rã là khoảng thời gian mà hoạt độ nguồn phóng xạ giảm đi một nửa.

Tia gamma phát ra từ các nguồn đồng vị phóng xạ, phổ biến là ⁶⁰Co (Cobalt-60) phát tia gamma có năng lượng 2,5 MeV, chu kỳ bán rã 5,27 năm và ¹³⁷Cs (Ceasium-137) phát tia gamma có năng lượng 0,66 MeV, chu kỳ bán rã 30 năm.

3.3.2.2. Chùm tia điện tử và tia X

Chùm tia điện tử được phát ra từ các máy gia tốc electron (electron accelerator). Máy có cấu tạo gồm hai bản cực. Cực âm là kim loại có khối lượng phân tử trung bình, có ái lực với electron thấp. Dưới tác dụng của điện thế rất cao giữa hai bản cực (10-100 kV), các electron này bật khỏi tấm kim loại và bay về phía bản cực dương. Trên đường đi của electron, người ta đặt các nam châm điện để định hướng lại quỹ đạo của electron bằng từ trường. Việc định hướng này làm các electron không đập vào bản cực dương mà bay vào các ống định hướng tia âm cực (Cathode Ray Tube, CRT). Đầu ra của các ống CRT này đặt sản phẩm mà ta muốn chiếu xạ. Chùm tia điện tử có độ xuyên vật chất thấp hơn tia gamma và tia X, nhưng có suất liều rất cao nên thời gian chiếu xạ nhanh.

Máy tạo tia X (máy gia tốc electron bức xạ hãm) có cấu tạo gần giống máy gia tốc electron. Tuy nhiên, cực dương của máy không phải là các ống CRT mà là tế bào quang điện. Tế bào quang điện là các mảnh kim loại có số khối lớn (gọi là bia biến đổi) như chì, wolfram, tantali, vàng… Luồng electron tốc độ cao mang năng lượng lớn sẽ bắn phá tế bào quang điện làm tế bào quang điện phát ra các sóng điện từ có bước sóng cực ngắn, đó là tia Roentgen (hay tia X, còn gọi bức xạ hãm). Các tia này có bước sóng từ 0,01 nm đến 1000 nm. Tia X có độ xuyên sâu mạnh (chỉ thua tia gamma). Máy tạo tia X có hiệu suất tạo bức xạ hãm thấp, chẳng hạn chì có hiệu suất tạo bức xạ hãm là 8%. Phần lớn năng lượng còn lại chuyển thành nhiệt. Vì vậy, tế bào quang điện rất nóng, phải dùng nước để tản nhiệt.

So với tia gamma, tia X có một số ưu điểm:

• Có định hướng, khoảng 50% lượng bức xạ hãm này đến được vật cần chiếu xạ. Trong khi bức xạ gamma từ nguồn đồng vị phóng xạ phát đều theo mọi hướng nên tỉ lượng bức xạ có ích rất thấp, ví dụ nguồn ¹³⁷Cs có hiệu suất chỉ 20%.
• Liều ổn định và đồng đều (các đồng vị phóng xạ có liều bức xạ giảm dần theo thời gian).
• Có thể điều khiển bật tắt được.

Bảng 7.8. Hiệu suất sử dụng năng lượng của các nguồn bức xạ

Nguồn bức xạ	Hiệu suất (%)
Máy gia tốc electron	66
Nguồn bức xạ hãm	50
Nguồn 60Co	25
Nguồn 137Cs	20

Nhìn chung các máy tạo bức xạ có các ưu điểm là công suất lớn, liều chiếu lớn, hiệu suất cao và có định hướng. Tuy cần tiêu tốn năng lượng khi vận hành nhưng ta có thể kiểm soát được liều lượng, cường độ và hướng chiếu xạ.

Theo quy định quốc tế, năng lượng các bức xạ ion hóa sử dụng cho chiếu xạ phải nhỏ hơn 5 MeV đối với tia gamma và tia X, nhỏ hơn 10 MeV đối với chùm tia điện tử. Hiện nay, đã có một số nước chấp nhận cho phép năng lượng tia X phát ra từ các máy gia tốc có thể đến 7,5 MeV.

• Điều chỉnh năng lượng bức xạ

Thông thường, nguồn bức xạ thường phát ra bức xạ vượt mức yêu cầu của quy trình công nghệ, nên phải điều chỉnh năng lượng bức xạ. Đối với các máy bức xạ thì việc điều chỉnh dễ dàng thông qua bộ phận điều khiển trên máy. Còn đối với các đồng vị phóng xạ thì phải sử dụng các chất hấp thụ bớt một phần năng lượng. Các chất thường dùng là các kim loại nặng, nước, nước nặng. Thường dùng nhất là chì và nước.

Một lưu ý quan trọng là vật liệu chế tạo thiết bị chiếu xạ và nhà xưởng cần đảm bảo để bức xạ không bị lọt ra ngoài gây nguy hiểm cho người vận hành, đặc biệt là bức xạ dạng tia gamma hay tia X do đặc tính xuyên sâu mạnh của nó. Với hai nguồn phóng xạ này thì vật liệu thích hợp là bê tông. Bề dày trung bình của bức tường là khoảng 2m. Ngoài ra với đồng vị phóng xạ cần có biện pháp bảo quản khi không vận hành. Thường các đồng vị phóng xạ tia gamma được đặt dưới bể nước sâu (trên 7m) để làm giảm mức nguy hiểm.

• Cơ chế diệt khuẩn

Các bức xạ ion hóa có thể gây kích thích, ion hóa các phân tử vật chất. Khi các phân tử của DNA bị ion hóa, các liên kết giữa chúng bị đứt gẫy. Nếu chiếu xạ đủ liều thì việc hồi phục các đứt gẫy trong cấu trúc DNA không thể thực hiện được. Khi đó, tế bào sẽ bị chết trong quá trình phân bào. Nếu có mặt nước trong môi trường vật chất, bức xạ ion hóa còn tạo ra các gốc tự do. Các gốc tự do là những tác nhân gây oxy hóa hoặc khử hóa mạnh, có khả năng phá hủy các phân tử thiết yêu trong tê bào sống.

Bảng 7.9. Liều xạ D của một số vi sinh vật

TT	Loài vi sinh	Liều xạ D (kGy)
1	Moraxella osloenensis	5-10
2	Micrococus Radiodurans	3-7
3	Clostridium Botulium	2-3,5
4	Bào tử của nấm	0,5-5
5	Saccharomys cervisiae	0,4 – 0,6
6	Salmonella	0,2-1
7	Staphylococcus aureus	0,2-0,6
8	Escherichia coli	0,1 -0,35
9	Pseudomonas	0,02-0,2

• Liều tiệt khuẩn:

Mức độ vi sinh vật bị tiêu diệt bằng bức xạ ion hóa phụ thuộc chủ yếu vào kích thước ADN, tốc độ hồi phục của chúng và một số yếu tố khác. Liều xạ D (liều xạ giảm thập phân, là liều tính theo kGy có tác dụng làm giảm số lượng vi sinh vật 10 lần) đối với côn trùng và ký sinh trùng có ADN lớn là khoảng 0,1 kGy, đối với vi khuẩn có ADN nhỏ hơn, khoảng từ 0,3-0,7 kGy và đối với virus là 10 kGy hoặc lớn hơn. Đốì với vi sinh vật ở dạng bào tử, liều xạ D cao hơn nhiều so với dạng sinh dưỡng, cỡ vài kGy.

Năng lượng hấp thụ bức xạ/đơn vị khối lượng vật chất tính bằng Gray (Gy, lGy = lJ/kg). Liều tiệt khuẩn bằng bức xạ ion hóa thường được đo bằng kilogray (kGy). Liều tiệt khuẩn được chấp nhận ở châu Âu và Mỹ là 25 kGy đối với các sản phẩm có độ nhiễm khuẩn ban đầu không vượt quá 1000 vi sinh vật/đơn vị sản phẩm. Liều này được xác định dựa trên thực nghiệm với các mẫu vật nhiễm nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, bào tử gây bệnh và không gây bệnh và cho chiếu xạ với nhiều mức liều khác nhau. Liều 25 kGy được chọn do có khả năng tiệt khuẩn tin cậy và giới hạn an toàn cao. Trên thực tế iiều 18-22 kGy cũng đạt mức bảo đảm vô khuẩn trên 10^-6.

Liều xạ D của bào tử Bacillus pumilis chiếu xạ trong không khí là l,7kGy. Do vậy, hệ số bất hoạt đôi với liều 25kGy là 10^25/17= 1015 (trong môi trường không có không khí, hệ số bất hoạt giảm còn 10⁷). Bào tử Bacillus pumilis được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về tiệt khuẩn bằng bức xạ ion hóa, vì nó đề kháng với bức xạ ion hóa tốt hơn hầu hết các bào tử vi sinh vật khác. Một số vi sinh vật không gây bệnh có khả năng đề kháng đặc biệt với bức xạ ion hóa. Ví dụ Micrococcus radiodurans có hệ số bất hoạt chỉ 10³ khi chiếu xạ với liều 25 kGy.

• Thời gian tiệt khuẩn

Xung điện tử cường độ lớn từ các máy gia tốc có thể phóng ra 1 liều tiệt khuẩn từ vài phần giây đến vài giây, tùy thuộc vào kích thước và tỉ trọng của sản phẩm cần tiệt khuẩn. Với các nguồn đồng vị, do bản chất khuếch tán và xuyên thấu của các bức xạ, suất liều tiệt khuẩn thấp hơn nhiều. Do vậy, liều xạ phải được tích luỹ qua nhiều giò (2-10 giờ). Tuy nhiên, thể tích của hàng hóa cần tiệt khuẩn cùng lúc có thể lớn hơn nhiều so với máy gia tốc.

• Kiểm soát quá trình tiệt khuẩn

Liều xạ được kiểm tra bằng xạ lượng kế đặt trong khối sản phẩm. Loại thông dụng nhất là vỉ hoặc đĩa Perspecx chứa phẩm màu nhạy cảm với tia xạ. Quá trình chiếu xạ làm thay đổi mật độ quang học của phẩm màu và có thể đo được bằng các máy quang phổ.

Với các quy trình tiệt khuẩn thường quy, có thể không cần đến các chỉ thị sinh học khi dùng liều chiếu xạ 25 kGy, vì liều này đảm bảo hiệu quả tiệt khuẩn tin cậy và đã được kiểm soát chính xác bằng xạ lượng kế.

• Ảnh hưởng không mong muốn

Tiệt khuẩn bằng bức xạ là phương pháp thích hợp với các dược phẩm và thiết bị nhạy cảm với nhiệt vì mức tăng nhiệt độ khi chiếu xạ rất nhỏ, chỉ trong khoảng 4°C. Tuy nhiên với liều xạ 25 kGy, sản phẩm có thể có những biến đổi về màu sắc và thành phần hóa học ngay hoặc sau thời gian bảo quản.

– Hoạt tính của hormon steroid và hầu hết kháng sinh không thay đổi hoặc hầu như không thay đổi, nhưng hoạt tính của cyanocobalamin, insulin, oxytocin bị giảm mạnh sau chiếu xạ. Do ảnh hưởng gián tiếp của chiếu xạ, sự phá hủy xảy ra mạnh hơn khi sản phẩm ở dạng dung dịch (ví dụ với heparin).

– Quá trình chiếu xạ thường được tiến hành khi sản phẩm đã được đóng gói trong bao bì, và chiếu xạ cũng ảnh hưởng phần nào đến chất lượng bao bì. Các loại bao bì có nguồn gốc vô cơ như thủy tinh, kim loại ít bị ảnh hưởng. Thủy tinh loại thường có thể trở nên sẫm màu. Các bao bì có nguồn gốc sinh học như giấy và các bao bì nhựa tổng hợp bị ảnh hưởng mạnh hơn. Tuy nhiên, bao bì tổng hợp như polyethylen, polystyren, cao su silicon thì hầu như không bị ảnh hưởng.

– Một số đồ vải hoặc nhựa có thể bị hỏng nếu xử lý chiếu xạ nhiều lần, hoặc xử lý bằng nhiệt ẩm sau khi đã xử lý bằng chiếu xạ. Một số sản phẩm đã xử lý chiếu xạ có thể hình thành chất có độc tính nếu xử lý tiếp bằng ethylen oxyd.

– Xử lý bức xạ chỉ gây nên những biến đổi hoá học không đáng kể và tỏ ra vô hại đối với thực phẩm, dược phẩm. Hiệu ứng bức xạ có thể tạo ra một số sản phẩm xạ lý (radiolytic products) như glucose, acid formic, acetaldehyd và carbon Các chất này cũng được tạo ra khi xử lý bằng nhiệt. Các sản phẩm xạ ly đã được nghiên cứu khá kỹ lưỡng và không có bằng chứng nào thể hiện tính độc hại của chúng.

– Các gốc tự do có thể được hình thành khi chiếu xạ cũng như khi xử lý bằng các phương pháp khác như nướng, sấy khô, đông khô và ngay cả trong quá trình oxy hoá bình thường của sản phẩm. Các gốc tự do có tính hoạt động rất cao, cấu trúc không ổn định nên dễ dàng tương tác với các cơ chất khác để trở thành dạng sản phẩm ổn định. Các gốc tự do dễ hình thành và cũng dễ biến mất một thòi gian ngắn sau khi chiếu xạ sản phẩm ở trạng thái lỏng. Tuy nhiên, các nghiên cứu độc tính trường diễn đã chứng minh chúng không gây nên bất kỳ hiện tượng nào về đột biến di truyền hoặc ung thư.

– Chiếu xạ trong các điều kiện được kiểm soát không làm cho thực phẩm biến thành chất phóng xạ. Bất kể loại vật liệu nào trong môi trường sống của chúng ta, kể cả thực phẩm, đều chứa một lượng cực nhỏ các nguyên tố có hoạt tính phóng xạ, được gọi là các nguyên tố phóng xạ tự nhiên. Tổng hoạt độ của các nguyên tố phóng xạ tự nhiên mà con người hấp thụ qua đường ăn uống hàng ngày vào khoảng 150-200 becquerel. Sản phẩm không tiếp xúc trực tiếp với chất phóng xạ mà chỉ bị chiếu tia gamma phát ra từ các chất phóng xạ và mức năng lượng tối đa của các nguồn chiếu xạ tiệt khuẩn luôn được giới hạn nhỏ hơn 5 MeV đối với bức xạ gamma, tia X và nhỏ hơn 10 MeV đối với bức xạ điện tử. Các giới hạn năng lượng trên là nhỏ so với năng lượng liên kết hạt nhân và vì vậy các bức xạ ion hóa này không có khả năng biến sản phẩm được chiếu xạ thành chất phóng xạ.

– Ứng dụng: Ở quy mô công nghiệp, tiệt khuẩn bằng chiếu xạ được áp dụng cho:

– Dược liệu, các sản phẩm từ dược liệu.

– Dụng cụ y tế: bơm tiêm nhựa, dây truyền dịch, găng tay, băng gạc, que khám, vật liệu cấy ghép, chỉ khâu, dao mổ, tăm giấy nha khoa, đĩa petri, băng dính, mặt nạ…

– Vỏ bao bì bằng một số loại nhựa, cao su, kim loại.

• Ưu nhược điểm:

– Tiệt khuẩn bằng chiếu xạ là phương pháp tiệt khuẩn lạnh, sinh nhiệt không đáng kể.

– Hiệu lực diệt khuẩn cao. Hệ số bất hoạt cao gấp khoảng 10 lần so với tiệt khuẩn bằng nhiệt. Đảm bảo độ vô khuẩn cao. Độ tin cậy và tính ổn định công nghệ cao.

– Độ xuyên thấu sản phẩm cao, cho phép tiệt khuẩn nguyên khối, nguyên bao bì, khối lượng lớn và liên tục.

– Một số vi khuẩn, virus có thể bị tiêu diệt mà không làm mất tính kháng nguyên.

– Không để lại dư độc tố trong sản phẩm sau khi tiệt khuẩn.

– Không gây hại cho môi trường.

Tuy nhiên, việc tiệt khuẩn bằng bức xạ ion hóa cũng có những nhược điểm riêng do tính đặc thù của phương pháp:

– Đầu tư ban đầu và chi phí sửa chữa, thay thế lớn.

– Các đồng vị phóng xạ cần được dùng liên tục 24 giờ/ngày vì phóng xạ được phát ra liên tục.

– Đòi hỏi cơ sở quản lý thiết bị phải có trình độ khoa học chuyên ngành.

– Vật liệu phải là loại tương thích với phóng xạ.

– Vì cường độ tối đa của bức xạ sử dụng đã được quy định cho mỗi một loại sản phẩm, thường thì ở mức độ rất thấp nên có thể có một số vi khuẩn vẫn còn sống sót và đột biến tạo ra những dòng vi khuẩn con cháu có khả năng đề kháng phóng xạ rất mạnh sau này.

– Vấn đề tai nạn phóng xạ và ô nhiễm môi sinh do phế thải phóng xạ.

3.4. Tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc

Phương pháp lọc thường được dùng để tiệt khuẩn các dung dịch kém bền nhiệt, không thể tiệt khuẩn trong bao bì cuối, được chấp thuận bởi Dược điển Anh từ năm 1993. Phương pháp cũng được áp dụng để lọc tiệt khuẩn các chất khí.

3.4.1. Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp là dẫn dung dịch cần tiệt khuẩn qua vật liệu lọc có khả năng giữ vi khuẩn. Vật liệu lọc thường dùng là các màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm hay nhỏ hơn, có khả năng giữ lại 100% vi khuẩn Pseudomonas diminuta. Các loại màng này có thể không giữ lại được các vi sinh vật nhỏ hơn như virus hay mycoplasm. Dung dịch sau khi lọc được đóng vào bao bì (đã tiệt khuẩn trước) và được hàn/đậy kín.

Một màng lọc lý tưởng cần đáp ứng các yêu cầu: không làm biến đổi dung dịch, không loại đi các thành phần cần thiết và không để lại các thành phần không mong muốn. Do vậy, các màng lọc thông dụng hiện nay chủ yếu được làm từ dẫn chất cellulose (cellulose acetat, cellulose nitrat) hoặc các polymer khác như: nylon, polyvinyl clorid, polycarbonat, polysulfon và Teflon (bảng 7.10). Đôi khi, màng lọc bằng kim loại nung kết (thép không rỉ, bạc) cũng được sử dụng trong trường hợp yêu cầu độ bền cao.

Các lỗ xốp ở bất cứ loại màng lọc nào cũng có kích thước phân bố trong một khoảng nhất định. Ví dụ nếu màng lọc có lỗ xốp được thiết kế là 0,2 µm sẽ có đường kính trung bình tối đa là 0,2 µm, với nhiều lỗ xốp nhỏ hơn và một số ít lỗ xốp lớn hơn 0,2 µm. Các lỗ xốp lớn có thể đến tối đa 0,5 µm, nhưng số lượng các lỗ xốp này rất ít và xác suất để một bào tử lọt qua là rất nhỏ. Tuy xác suất là rất nhỏ nhưng khả năng bào tử lọt qua màng vẫn có thể xảy ra. Do vậy, phương pháp lọc dùng những loại màng đó không được coi là phương pháp tiệt khuẩn có độ tin cậy cao. Để tăng đô tin cây của phương pháp, có thể cho dung dịch qua 2 màng lọc 0,2 µm liên tiếp. Cũng có thể dùng loại màng lọc có kích thước lỗ xốp 0,1 µm, nhưng tốc độ lọc sẽ giảm đi rất nhiều.

Bảng 7.10. Đặc điểm một số loại màng lọc tiệt khuẩn

Loại màng lọc	Ứng dụng chính	Dung môi cần tránh
Màng thân nước:
Acrylic copolymer (trên nền nylon)	Dung dịch nước, alcol và glycol	Dimethyl formamid
Cellulose acetaưnitrat	Dung dịch nước	Benzyl alcol, ethanol, propylen glycol, Dimethylformamid
Nylon (polyamid)	Dung dịch nước và các dung môi dược phẩm	Chịu được dung môi
Polycarbonaưpolysulíon	Dung dịch nước	Benzyl alcol, Dimethylformamid
Polyvinyliden difluorid	Dung dịch nước chứa đến 35% dung môi	Aceton, Dimethyl formamid
Màng sơ nước:
Polytetrafluorethylen (trên nền polyethylen hoặc polypropylen)	Không khí và dung môi không chứa nước. Dung dịch nước (làm ướt trước bằng ethanol)	Chịu được dung môi
Polyvinyliden difluorid	Không khí và dung dịch nước (làm ướt trước bằng ethanol)	Aceton, Dimethyl formamid

3.4.2. Kiểm tra màng lọc

Trước khi dùng, thiết bị lọc tiệt khuẩn cần được kiểm tra tính nguyên vẹn và kích thước lỗ xốp bằng các thử nghiệm thích hợp.

Phương pháp đơn giản và nhanh nhất là thử nghiệm đo áp suất điểm sủi bọt (bubble point test). Điểm sủi bọt của một màng lọc là áp suất tại đó lỗ xốp lớn nhất của màng lọc đã thấm ướt có thể cho không khí đi qua. Áp suất sủi bọt phụ thuộc vào sức căng bề mặt của dung môi dùng thấm ướt màng và tỉ lệ nghịch với đường kính lỗ xốp. Với màng lọc 0,2 µm loại thân nước và được thấm ướt bằng nước, áp suất sủi bọt thường trong khoảng 3-4 bar. Nếu màng lọc có khuyết tật, hoặc màng bị rách trong quá trình lắp ráp, điểm sủi bọt sẽ được phát hiện ở áp suất thấp hơn nhiều. Với màng lọc sơ nước, dung môi thấm ướt là ethanol hoặc methanol. Thử nghiệm này thường dùng để kiểm tra hệ thống lọc tiệt khuẩn trước và sau khi dùng.

Phương pháp kiểm tra trực tiếp khả năng giữ khuẩn của màng lọc bằng cách lọc qua màng một hỗn dịch chứa lượng lớn vi khuẩn kích thước nhỏ (ví dụ Pseudomonas diminuta) trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Dịch lọc sau đó được kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn, qua đó đánh giá được chất lượng của màng lọc.

3.4.3. Sản xuất vô khuẩn

Trong quá trình sản xuất vô khuẩn, sản phẩm chờ đóng gói, vật chứa rỗng và nắp đậy được tiệt khuẩn riêng rẽ sau đó kết hợp với nhau trong điều kiện vô khuẩn để thu được sản phẩm cuối. Bởi vì sản phẩm đã đóng gói không được tiệt khuẩn bổ sung bằng bất kỳ phương pháp nào khác nên quá trình sản xuất phải tiến hành trong điều kiện môi trường có chất lượng rất cao. Trước khi phối hợp, mỗi thành phần của sản phẩm cuối phải được tiệt khuẩn riêng bằng phương pháp thích hợp, ví dụ bằng nhiệt khô vối vật chứa bằng thủy tinh, bằng nhiệt ẩm với nắp đậy bằng nhựa và bằng phương pháp lọc đối với các dung dịch. Để duy trì tính vô khuẩn của mỗi thành phần trong quá trình sản xuất phải chú ý đến các yếu tố sau:

• Môi trường sản xuất.
• Con người.
• Các bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm hở.
• Qui trình tiệt khuẩn các vật liệu bao gói và qui trình vận chuyển chúng vào khu vực đóng gói.
• Thời gian lưu trữ tối đa của sản phẩm chò đóng gói trước khi đóng vào bao bì cuối.

Để đảm bảo tính vô khuẩn của thành phẩm, cả qui trình tiệt khuẩn và qui trình đóng gói đều phải được thẩm định bằng phương pháp thích hợp trước khi áp dụng trong thực tế.

4. Thẩm định và kiểm soát quá trình tiệt khuẩn

Tất cả các phương pháp tiệt khuẩn (nhiệt, hóa chất, bức xạ, lọc) đều nhăm phá hủy hoặc loại bỏ vi sinh vật nhiễm trong sản phẩm. Trong khi phép thử độ vô khuẩn là thử nghiệm phá hủy mẫu. Do vậy, không thể đảm bảo độ vô khuẩn của sản phẩm bằng cách thử vô khuẩn. Độ vô khuẩn của sản phẩm chỉ có thể đảm bảo bằng cách áp dụng một qui trình sản xuất và tiệt khuẩn đã được thẩm định thích hợp. Đối với mỗi qui trình tiệt khuẩn đã chọn, phải tiến hành khảo sát để đảm bảo hiệu quả tiệt khuẩn và tính toàn vẹn của sản phẩm, bao gồm cả vật chứa và bao gói bên ngoài, trước khi áp dụng vào thực tế. Trong quá trình sản xuất, phải tuân thủ đúng qui trình tiệt khuẩn đã thẩm định. Nếu có thay đổi lớn trong qui trình tiệt khuẩn, bao gồm cả sự thay đổi kích cỡ lô, phải tái thẩm định qui trình. Trong khi xây dựng qui trình sản xuất các sản phẩm vô khuẩn, phải tuân theo các nguyên tắc thực hành tốt sản xuất, cụ thể là:

• Sử dụng công nhân lành nghề đã trải qua quá trình huấn luyện thích hợp.
• Thiết kế nhà xưởng phù hợp.
• Thiết kế máy móc, thiết bị sản xuất sao cho dễ vệ sinh và dễ tiệt khuẩn.
• Áp dụng các biện pháp phòng ngừa thích hợp nhằm làm giảm số lượng vi sinh vật trong sản phẩm trước khi tiệt khuẩn.
• Thẩm định qui trình sản xuất cho tất cả các công đoạn trong dây chuyền sản xuất có nguy cơ nhiễm khuẩn.
• Thiết lập và thực thi chương trình giám sát chất lượng môi trường sản xuất và các qui trình kiểm tra trong quá trình sản xuất.

Nếu có thể, việc thẩm định và kiểm soát quá trình tiệt khuẩn nên đánh giá thông qua các chỉ thị sinh học hoặc hóa học, hơn là việc thử độ vô khuẩn của sản phẩm sau tiệt khuẩn.

4.1. Chỉ thị dùng đánh giá quá trình tiệt khuẩn

4.1.1. Chỉ thị sinh học

Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn là những chế phẩm sinh học đã tiêu chuẩn hóa, được sản xuất từ các vi sinh vật chọn lọc, dùng để đánh giá hiệu quả của các qui trình tiệt khuẩn. Chỉ thị sinh học thường được sản xuất bằng cách cấy một lượng bào tử vi sinh vật chỉ thị lên vật mang trơ, ví dụ băng giấy lọc, bản mỏng thủy tinh hay ống plastic, sau đó đóng gói vật mang đã cấy khuẩn vào bao bì thích hợp nhằm bảo vệ sản phẩm tránh bị biến chất và tạp nhiễm. Vật liệu dùng làm bao gói phải bền, không bị phân hủy trong quá trình tiệt khuẩn, nhưng phải cho tác nhân tiệt khuẩn thấm vào bên trong để tiếp xúc với vi khuẩn. Hỗn dịch bào tử vi khuẩn đóng trong ống thủy tinh kín cũng có thể được dùng làm chỉ thị sinh học.

Đối với các chế phẩm lỏng, có thể cấy trực tiếp bào tử vi khuẩn chỉ thị vào một số đơn vị đóng gói đại diện của sản phẩm cần tiệt khuẩn hay vào chất lỏng có thành phần gần giống sản phẩm, nếu không thể cấy trực tiếp vào sản phẩm thật. Trong trường hợp này, phải có biện pháp kiểm tra thích hợp để đảm bảo bản thân chế phẩm hay sản phẩm giả đều không có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị.

Các thông tin bắt buộc phải cung cấp kèm theo mỗi chỉ thị sinh học bao gồm: tên loài vi khuẩn dùng làm vi sinh vật đối chiếu, số định danh loài của bảo tàng giống gốc, số lượng bào tử sống trên mỗi vật mang, hạn dùng và trị số D. Chỉ thị sinh học có thể gồm hai hay nhiều loài vi khuẩn trên một vật mang, nhưng không được lẫn tạp khuẩn. Ngoài ra, trên nhãn chỉ thị sinh học phải cung cấp thông tin về môi trường nuôi cấy và điều kiện ủ.

Để kiểm tra một qui trình tiệt khuẩn, đặt chỉ thị sinh học tại vị trí được giả định, hoặc đã được xác định trước bằng phương pháp vật lý thích hợp khi có thể, là nơi mà tác nhân tiệt khuẩn khó luân chuyển đến nhất trong buồng tiệt khuẩn. Sau khi cho tiếp xúc với tác nhân tiệt khuẩn, chuyển vật mang vào trong môi trường dinh dưỡng thích hợp trong điều kiện vô khuẩn và đem ủ. Đối với chỉ thị sinh học đóng trong ống thủy tinh kín có chứa sẵn môi trường dinh dưỡng thì đem ủ ngay.

Các vi khuẩn chỉ thị được chọn lựa theo nguyên tắc:

a) Sức đề kháng của vi khuẩn chỉ thị đối với phương pháp tiệt khuẩn đã cho phải lớn hơn sức đề kháng của tất cả các vi khuẩn gây bệnh và các vi khuẩn có khả năng nhiễm vào sản phẩm cần tiệt khuẩn.

b) Không gây bệnh.

c) Dễ nuôi cấy.

Sau khi ủ, nếu quan sát thấy vi khuẩn chỉ thị phát triển, chứng tỏ qui trình tiệt khuẩn đã sử dụng không đạt yêu cầu.

Để thẩm định, đánh giá một quá trình tiệt khuẩn, việc lựa chọn chỉ thị sinh học là yếu tố quyết định. Khả năng sống của vi sinh vật, điều kiện bảo quản trước khi dùng, môi trường và điều kiện nuôi cấy sau khi tiệt khuẩn cần được tiêu chuẩn hóa để kết quả thu được có ý nghĩa. Ngoài ra, để sử dụng hiệu quả chỉ thị sinh học, cần biết số lượng ban đầu và sức đề kháng của vi sinh vật đối với phương pháp tiệt khuẩn.

Một số vi sinh vật sau thường được làm chỉ thi sinh học:

Bacillus subtilisvar. niger – nhiệt khô, ethylen oxyd.

Bacillus stearothermophilus – nhiệt ẩm.

Bacillus sporogenes- nhiệt ẩm.

Bacillus pumilus- bức xạ ion hóa.

4.1.2. Chỉ thị hóa học

Là các chất có thể thay đổi tính chất vật lý hoặc bản chất hóa học khi tiếp xúc với các điều kiện tiệt khuẩn. Chỉ thị hóa học dùng để xác định một lô sản phẩm đã được xử lý tiệt khuẩn hay chưa, nhưng thường không chỉ ra được quá trình tiệt khuẩn có thành công hay không.

Ống Browne:

Là các ống thủy tinh hàn kín (sản xuất bởi hãng A. Browne) có chứa chất lỏng màu đỏ, màu này chuyển qua vàng, nâu đến xanh khi tiếp xúc với nhiệt trong một thời gian nhất định.

Băng nhạy nhiệt:

Trong thiết bị autoclave áp suất cao, chỉ thị cho biết không khí trong các vật xốp đã được thay thế bởi hơi nước hay chưa. Chỉ thị là một dải băng có các vạch nhạy cảm nhiệt đặt cách nhau khoảng 15 mm. Các vạch này thay đổi màu sau khi tiếp xúc với hơi nước.

Chỉ thị Thermalog S:

Chỉ thị Thermalog s cấu tạo gồm 1 bấc giấy và các hạt màu nhạy cảm với hơi nước và nhiệt độ. Khi tiếp xúc với hơi nước, các hạt này chảy ra thành chất lỏng có màu và di chuyển dọc theo bấc giấy và làm sẫm màu bấc giấy. Quãng đường di chuyển trên bấc giấy phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian tiếp xúc với hơi nước, và có thể được hiệu chỉnh với đường cong bất hoạt của vi sinh vật chỉ thị Bacillus sterothermophilus, qua đó có thê tính được trị số F₀.

Chỉ thị cho tiệt khuẩn hằng ethylen oxyd:

Các gói Royce có chứa chất chỉ thị có thể thay đổi màu khi tiếp xúc với ethylen oxyd ở các nồng độ và thời gian khác nhau.

Xạ lượng kế hóa học:

Dùng để kiểm soát liều chiếu xạ trong trường hợp tiệt khuẩn bằng tia bức xạ.

4.2. Các bước thẩm định quá trình tiệt khuẩn

Thẩm định một quy trình tiệt khuẩn phải được thực hiện một cách hợp lý và có hệ thông. Ví dụ thẩm định một quy trình tiệt khuẩn bằng hơi nước có thể gồm các bước như sau:

• Đảm bảo thiết bị tiệt khuẩn đã được kiểm tra và đủ điều kiện hoạt động.
• Lựa chọn vi sinh vật chỉ thị phù hợp nhất. Đồng thời, xác định bằng thực nghiệm trị số D và Z cùng với những ưu điểm và nhược điểm của chỉ thị sinh học đã chọn.
• Xác định sự phân bố nhiệt và vị trí nguội nhất trong trong buồng tiệt khuẩn rỗng.
• Xác định sự phân bố nhiệt và vị trí nguội nhất của lô sản phẩm có hình dạng và kích thước nhất định trong buồng tiệt khuẩn.
• Xác định khả năng truyền nhiệt trong một đơn vị sản phẩm tại vị trí nguội nhất của buồng tiệt khuẩn và những vị trí nghi ngờ khác.
• Đánh giá ảnh hưởng của các thông số tiệt khuẩn như thời gian, nhiệt độ, cách sắp xếp lô sản phẩm trong buồng tiệt khuẩn đến sự phá hủy chỉ thị sinh học và độ lớn của giá trị F₀.
• Xác định thời gian tiệt khuẩn cần thiết để đạt được giá trị F₀ mong muốn và/hoặc mức độ phá hủy chỉ thị sinh học mong muốn.
• Thực hiện lại quá trình tiệt khuẩn đến khi kết quả có độ lặp lại và tin cậy.
• Ban hành quy trình thao tác chuẩn và thiết lập chương trình kiểm tra định kỳ đối với quy trình tiệt khuẩn đã chọn.

Thẩm định chu trình tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc có thể theo các bước như sau:

• Đảm bảo nhà xưởng và thiết bị đủ tiêu chuẩn và hoạt động tốt.
• Tiến hành thử nghiệm vi sinh vật nhiễm trong không khí và trên bề mặt khu vực tiệt khuẩn và đóng gói.
• Chọn loài vi sinh vật thích hợp nhất dùng trong thẩm định và môi trường nuôi cấy thích hợp.
• Tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và tất cả các thiết bị, dụng cụ tiệt khuẩn bằng một phương pháp tiệt khuẩn đã thẩm định trước.
• Tiến hành một thử nghiệm tương tự bằng cách lọc một thể tích môi trường nuôi cấy có chứa vi sinh vật chỉ thị với nồng độ đã biết, vào các đồ đựng đã tiệt khuẩn trước.
• Nuôi cấy các mẫu ở điều kiện thích hợp. Xác định tỉ lệ mẫu có vi sinh vật phát triển.
• Lặp lại quá trình thử nghiệm đến khi thu được kết quả tin cậy.

Câu hỏi lượng giá

1. Động học quá trình bất hoạt vi sinh vật?
2. Khái niệm và ý nghĩa các đại lượng đặc trưng: mức bảo đảm vô khuẩn, trị số giảm thập phân, hệ số phá hủy nhiệt, giá trị tiệt khuẩn F₀?
3. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm: Nguyên tắc, ứng dụng và ưu nhược điểm, hơi nước bão hòa (khái niệm, các dạng nhiệt năng, các ưu điểm), cấu tạo và các bước vận hành nồi hấp?
4. Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô: Cấu tạo và vận hành tủ sấy, các yêu cầu vật cần tiệt khuẩn, ứng dụng, ưu nhược điểm?
5. Tiệt khuẩn bằng chất khí: đặc điểm, hoạt tính và cơ chế diệt khuẩn các yêu tố ảnh hưởng, các phương pháp loại tác nhân tiệt khuẩn khỏi sản phẩm sau tiệt khuẩn, ứng dụng, ưu nhược điểm?
6. Tiệt khuẩn bằng bức xạ ion hóa: đặc điểm các nguồn bức xạ ion hóa cơ chế diệt khuẩn, ảnh hưởng không mong muốn, ứng dụng, ưu nhược điểm?
7. Tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc: nguyên tắc, ứng dụng, phương pháp kiểm tra chất lượng màng lọc tiệt khuẩn?