[Chia sẻ] Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất các vitamin B12

Bài viết sau đây, nhà thuốc Ngọc Anh xin chia sẻ về Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất các vitamin B12

Đại cương về vitamin B12

• Vitamin B12 có cấu tạo gồm 2 phần chính là khung corin với nguyên tử coban ở trung tâm và nhóm 5,6 DMB. Nó còn có tên khác là cyanocobalamin.
• Vitamin B12 có các dẫn chất khác nhau tùy vào nhóm mà nguyên tử coban kết hợp cùng như vitamin B12 có nhóm CN; vitamin B12a có nhóm hydroxyl; vitamin B12b nguyên tử coban kết hợp với một phân tử nước; vitamin B12c có nhóm NO; methyl vitamin B12 có gắn nhóm methyl; coenzyme B12 có nhóm 5’ deoxy adenosyl
• Vitamin B12 là các tinh thể có hình kim màu đỏ sẫm, không mùi không vị, dễ hút ẩm (độ ẩm lên tới 12 %). Vitamin B12 dễ tan trong các dung môi phân cực tốt như nước hay các alcol nhưng không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether, aceton và chloroform.

Các phương pháp sản xuất vitamin B12

Từ năm 1948 2 nhà khoa học ricker và S.Parkers đã chiết được B12 từ cao gan nhưng với hàm lượng từ 10 đến 20 mg/ 1 tấn. Lượng này quá thấp để có thể áp dụng trong sản xuất với quy mô lớn. Sau đó các nhà khoa học đã phát hiện ra ngoài gan ở động vật, các vi khuẩn khác cũng có khả năng tổng hợp được vitamin B12. Từ đó các phương pháp mới được ra đời như chiết vitamin B12 từ bùn cống, từ nước thải của công nghiệp kháng sinh và đặc biệt là lên men công nghiệp.

Chiết từ bùn cống

Được giới thiệu bởi 2 nhà khoa học Frieric và Berna vào năm 1951. 2 nhà khoa học này đã phát hiện ra khả năng sinh tổng hợp B12 từ vi khuẩn sinh metan có trong bùn cống. Hàm lượng trong bùn khô (sau ủ) từ 0.5 đến 1 mcg/ 1g- tuy vẫn còn thấp nhưng cao hơn đáng kể so với chiết từ mô động vật. Phương pháp này có ưu điểm là tận dụng được phế phẩm từ các ngành công nghiệp khác, sử dụng được cho gia súc và hàm lượng vitamin B12 cũng giúp xác định được mức độ ô nhiễm môi trường.

Chiết từ nước thải của công nghiệp kháng sinh

• Dựa trên khả năng sản xuất vitamin B12 từ các xạ khuẩn như str.griseus, Str. Aureofaciens… Hàm lượng vitamin vào khoảng 40 mg trong 100 lít nước thải. Phương pháp này có ưu điểm là tận dụng được phế phẩm từ ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh, nhưng lượng vitamin B12 thu được còn ít.
• Lên men công nghiệp: dựa trên khả năng tổng hợp vitamin B12 của vi khuẩn propionibacterium Shermanii trong môi trường lên men chìm kị khí. Hàm lượng vitamin B12 thu được tăng lên đáng kể 150 mg/l.

Lên men vitamin B12

Cũng gồm 3 giai đoạn chính là chuẩn bị trước lên men, tiến hành lên men và thu sản phẩm.

Trước lên men:

Chuẩn bị chủng giống: phân lập đến cấp chủng của Propionibacterium shermanii hoặc Propionibacterium freudenreichii- các vi khuẩn này kỵ khí và hiếu khí không bắt buộc. Đặc biệt chúng phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí.

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng:

• Nguồn Hydrocarbon: gồm các đường đơn hoặc đôi (đường tan) như glucose hay saccarose- do vi khuẩn này không có các men để tiêu hóa được các mạch hydrocarbon dài. Các đường này không chỉ cung cấp năng lượng để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mà nó còn cung cấp mạch carbon cho khung corin.
• Nguồn Nitơ: sử dụng nguồn hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn vô cơ như muối amoni, còn nguồn hữu cơ dùng các acid amin đặc biệt methionine giúp tăng hiệu suất từ 10 đến 12%. Cũng như nguồn hidrocacbon, nó không chỉ cung cấp năng lượng, cung cấp vật chất để vi khuẩn phát triển, nó cũng cung cấp các nhóm amin cho khung corin.
• Ion kim loại: đặc biệt là coban- tăng hiệu suất tổng hợp, do khung corin có nguyên tử coban. Có thể sử dụng các muối coban nitrat hoặc coban clorua. Các kim loại khác như Fe, Cu, Zn, Mn sẽ cạnh tranh với coban làm giảm hiệu suất.

• Vitamin: vitamin B1, biotin, acid nicotinic, acid folic. Các vitamin này kích thích sinh trưởng, tăng tạo sinh khối của vi khuẩn.
• Sử dụng chất tiền thể 5,6 DMB- kết hợp với khung corin để tạo vitamin B12. Chất này được cho thêm vào môi trường nuôi cấy tại giờ thứ 72 với nồng độ từ 1 đến 10 mg/l. Không bổ sung 5,6 DMB sớm hơn do chúng có nhân benzen có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Tại giờ thứ 72, vi khuẩn mới bắt đầu tổng hợp vitamin B12 và đã đạt được lượng sinh khối thích hợp, nên bổ sung vào thời điểm này là thích hợp nhất.

Trong quá trình lên men:

• Nhiệt độ: ưa mát từ 28 đến 30 độ C.
• pH: hơi trung tính, từ 6.8 đến 7.2, sử dụng NH4OH để điều chỉnh pH. Sử dụng NH4OH  không chỉ bổ sung nguồn N cho vi khuẩn mà nó còn là một base nhẹ, nên khi xảy sự cố điều chỉnh sẽ dễ dàng.
• Chế độ cấp khí: vì là vi khuẩn kị khí nên trong 50 giờ đầu phải được nuôi cấy trong môi trường kỵ khí bắt buộc- để vi sinh vật tập trung phát triển sinh khối. Sau 50 giờ, thực hiện cấp khí 15 ph/h, vì vi khuẩn cần có O2 để gắn nhân corin và 5,6 DMB.
• Thời gian lên men từ 6 đến 7 ngày tương ứng với cuối pha cân bằng trong chu kỳ phát triển của vi khuẩn (vì vitamin là sản phẩm trao đổi chất).
• Hiệu suất cho sản phẩm từ 80 đến 100 mg/L.

Giai đoạn thu sản phẩm

Gồm các bước thu sinh khối; giải phóng vitamin B12, chiết vitamin B12; Cyanide hóa; tinh chế; kết tinh và bước cuối là định lượng.

• Thu sinh khối: vi vitamin B12 là sản phẩm nội bào, nên tiến hành thu sinh khối và loại tế bào. Có thể sử dụng các phương pháp như lọc (lọc tiếp tuyến, lọc khung bản), ly tâm.
• Giải phóng vitamin B12: cần tiến hành phá vỡ tế bào để thu được vitamin B12, sử dụng acid để phá vỡ tế bào. sinh khối thu được sẽ phân tán vào trong nước để thu hỗn dịch. Bổ sung thêm HCl 10% đến khi pH môi trường khoảng 4,5 (đủ để phá vỡ tế bào ở nhiệt độ cao, không quá thấp để ít ảnh hưởng đến độ ổn định của vitamin). Sau đó, đun nóng môi trường đến 80 độ C trong 30 phút để thành tế bào phân hủy và giải phóng tế bào chất (trong có chứa B12). Tiến hành lọc lấy dịch.
• Chiết vitamin B12: dịch lọc thu được sẽ được tách chiết với hỗn hợp phenol: butanol (tỉ lệ 1:1); vitamin sẽ được chuyển từ pha nước sang pha dung môi hữu cơ này và loại được các thành phần tan trong nước như protein. Sau đó lại tiếp tục chiết với nước với tỉ lệ thể tích hữu cơ trên nước là 1/3. Sau đó chiết B12 lại nhiều lần bằng nước. Việc chiết nhiều bước như vậy giúp loại bỏ được các thành phần tan trong dung môi hữu cơ như chất béo, nhựa.

• Cyanide hóa: bởi vì sản phẩm thu được ngoài vitamin B12 còn có các dẫn chất của chúng, nên cần cyanide hóa để chuyển các thành phần này về B12. Trước tiên điều chỉnh pH trong khoảng từ 8.0 đến 8.5 (môi trường kiềm để thuận lợi cho quá trình phản ứng và ảnh hưởng đến độ bền của KCN), sau đó cho KCN để tiến hành phản ứng cyanid. Để phản ứng diễn ra trong khoảng 3 giờ để chuyển toàn bộ coenzyme thành vitamin B12. Hệ thu được sẽ được cô chân không ở nhiệt độ dưới 60 độ C đến nồng độ 10 mg/ ml (nhiệt độ không quá cao để tránh ảnh hưởng đến độ ổn định của vitamin).
• Tinh chế: dịch đặc được pha loãng trong hỗn hợp acetone- nước (1:3) sẽ được hấp phụ lên cột oxyd nhôm (đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 300 độ C/1 giờ); sau đó phản hấp phụ bằng aceton-nước (tỉ lệ 1: 1), lấy phân đoạn cho B12 đậm đặc nhất.
• Kết tinh: dung dịch B12 sau tinh chế sẽ được kết tinh trong aceton (vitamin B12 không tan trong aceton), khuấy nhẹ và để trong 12 giờ ở 4 độ C- ở đây sử dụng cả 2 phương pháp là hạ nhiệt độ và thay đổi dung môi để tạo dung dịch quá bão hòa của vtm B12. Tinh thể thu được sẽ được lọc loại dịch; rửa bằng aceton và sấy khô bằng bình hút ẩm. Yêu cầu hàm lượng vtm B12 thu được phải trên 95%.
• Định lượng: sản phẩm thu được sẽ đem định lượng để xác định hàm lượng. Có 2 phương pháp sử dụng là hóa lý (đo quang tại bước sóng 361 nm) và phương pháp vi sinh vật (sử dụng E.coli).

Tài liệu tham khảo:

• Slide bài giảng học phần “công nghệ vi sinh”- ThS Lê Ngọc Khánh- Trường Đại học Dược Hà Nội.
• Health Benefits of Vitamin B12, Webmd, truy cập ngày 7/6/2023.

Tham khảo thêm: Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất các sản phẩm probiotic