LACTOBACILLUS RHAMNOSUS
LACTOBACILLUS RHAMNOSUS
Lactobacillus rhamnosus
Định nghĩa
Lactobacillus rhamnosus là trực khuẩn Gram dương, lên men dị hình, không sinh bào tử. Tế bào hình que hai đầu vuông, không di động đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi.
Lactobacillus rhamnosus không thủy phân được Arginin. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau khi lên men, trước khi tiến hành đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus rhamnosus không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.
Chủng HN001: Chủng HN001 là chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus đặc trưng, thuần chủng, có plasmid, không sinh D-lactat.
Chủng GG: Chủng GG là chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus đặc trưng, thuần chủng, không có plasmid, không sinh D-lactat.
Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Lactobacillus rhamnosus HN001 và Lactobacillus rhamnosus GG.
Định tính
A. Định tính bằng kính hiển vi.
Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.
Tiêu chuẩn chấp nhận:
Chủng HN001: Trực khuẩn hình que có độ dài khác nhau, thường xếp thành chuỗi ngắn.
Chủng GG: Trực khuẩn nhỏ hình que, có kích thước đồng nhất, xếp thành chuỗi.
B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.
Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotics trong dung dịch đệm TE IX (TT) có nồng độ 100 mg/ml.
Mồi đặc hiệu: xem Bảng 1.
Bảng 1 – Cặp mồi đặc hiệu và tiêu chuẩn chấp nhận tương ứng
| Chủng | Mồi đặc hiệu | Trình tự mồi xuôi | Trình tự mồi ngược | Tiêu chuẩn chấp nhận* |
| HN001 | 1 | (5′-3′) CACCTGCGAT-CAAAGCGAAAC | (5′-3′) GCTCCCACCGGC-ACATTA | Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 340 cặp base. |
| GG | 1 | (5′-3′) GTGATCGGAACATCTT-TGGCCACTTGTTTG | (5′-3′) ACTTAATCAAACAA-GGCAAGCTGGACGATG | Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 552 cặp base, đối với chủng khác có thể thu được sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khác. |
| 2 | (5′-3′) TTCCACATTGCG-CCAAACA | (5′-3′) ACAACCTTCACC-ACGACCAA | Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 388 cặp base có một đa hình đơn nucleotid SNP (SNP: Single-nucleotide polymorphism), có thể thu được sản phẩm khuyếch đại gen -có kích thước tương tự đối với chủng khác.
Vị trí SNP này được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 21 cặp base có trình tự như sau: ACCAATGTAAaCATACCCATC và vị trí SNP này là cặp base thứ 250 tính từ đầu 3′ của mồi xuôi. Trình tự của sản phẩm khuếch đại gen này nên được xác định bằng các kỹ thuật giải trình tự đã được thẩm định, ví dụ như phương pháp Sanger. |
|
| 3 | (5′-3′) GCCGGTTGTCAG-TGACCATA | (5′-3′) AGACAAATGCC-TGGATGCCT | Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 293 cặp base với hai SNP; có thể thu được sản phẩm khuyếch đại gen có kích thước tương tự đổi với chủng khác. Vị trí SNP đầu tiên được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 21 cặp base có trình tự như sau: TCTTCCCGACtTTAGCAGGGA và vị trí SNP này là cặp base thứ 71 tính từ đầu 3′ của mồi xuôi 3. Vị trí SNP thứ hai được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 21 cặp base có trình tự như sau: TCAGGCGCAtTATGAAGATGG và vị trí của SNP này là cặp base thứ 98 tính từ đầu 3′ của mồi xuôi. Trình tự của sản phẩm khuếch đại gen nên được xác định bằng các kỹ thuật giải trình tự đã được thẩm định, ví dụ như phương pháp Sanger. | |
| (5′-3′) TGCAACACATCA-AGCGATTGG | (5′-3′) TCATAACCAGCAT-ACGCCGG | Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 490 cặp base. Không được có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 367 cặp base, có thể thu được sản phẩm khuyếch đại gen có kích thước tương tự đối với chủng khác. |
Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 µM bằng dung dịch đệm, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 µM bằng dung dịch đệm, bảo quản ở -20 °C.
Mẫu thử: Chuẩn bị dung dịch chứa 12,5 µL PCR master mix1, 1 µL dung dịch mồi xuôi (25 µM), 1 µL dung dịch mồi ngược (25 µM), 9,5 µL nước vô khuẩn và 1 µL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.
Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 µL nước vô khuẩn
Mẫu chứng dương: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 µL khuôn DNA của chủng chuẩn Lactobacillus rhamnosus HN001/GG hoặc thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng chuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus.
Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương tương ứng trên cùng một máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt như sau:
Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 10 min; Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 57 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C.
Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lactobacillus rhamnosus HN001/GG bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.
Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on – chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2% trong dung dịch đệm TAE IX (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/ml hoặc thuốc nhuộm gel phù hợp khác và rửa gel bằng nước.
Có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.
Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến, nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thang chuẩn DNA có kích thước phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại thu được. Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước của các sản phẩm khuyếch đại, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên gel.
Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như được quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus làm chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.
Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.
Định lượng
Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus rhamnosus không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.
Giới hạn nhiễm vi sinh vật
Tổng số nấm: Không được quá 102 CFU/g (Phụ lục 13.6).
Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không được quá 5 × 103 CFU/g (Phụ lục 1.26).
Vi sinh vật gây bệnh
Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).
Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).
Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).
Bảo quản
Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.
Ghi nhãn
Phải ghi tên chi, loài, chủng và số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc theo đơn vị tương đương trên nhẫn.
Ghi chú
1AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.
Tài liệu tham khảo
Dược Điển Việt Nam 6 – phiên bản mới nhất của Dược Điển Việt Nam do Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 3960/QĐ-BYT ngày 26/12/2025. Trang 1754-1756, tải PDF tại đây