LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
Lactobacillus acidophilus
Định nghĩa
Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn sinh acid lactic, không di động, không sinh bào tử, lên men đồng hình, trực khuẩn Gram dương hình que, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau khi lên men trước khi đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus acidophilus không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.
Chủng La-14: Lactobacillus acidophilus La-14 (mà hóa chúng theo ATCC là SD5212) là chủng vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus đặc trưng, thuần chủng, sản phẩm lên men có 60% L-lactat và 40% D- lactat.
Chủng NCFM: Lactobacillus acidophilus NCFM (mã hóa chủng theo ATCC là SD5221) là chủng vi khuẩn Lactobacilus acidophilus đặc trưng, thuần chủng, sản phẩm lên men có 66% L-lactat và 34% D-lactat.
Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Lactobacillus acidophilus La-14 và Lactobacillus acidophilus NCFM.
Định tính
A. Định tính bằng kính hiển vi.
Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.
Tiêu chuẩn:
Chủng La-14: Trực khuẩn hình que.
Chủng NCFM: Trực khuẩn hình que, xếp thành chuỗi ngắn.
B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.
Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotic trong dung dịch đệm TE IX (TT) có nồng độ 100 mg/ml.
Mồi đặc hiệu: xem Bảng 1.
Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 µM bằng dung dịch đệm, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 µM bằng dung dịch đệm, bảo quản ở -20 °C.
Mẫu thử: Chuẩn bị dung dịch chứa 10 µL PCR master mix1, 1 µL dung dịch mồi xuôi (25 µM), 1 µL dung dịch mồi ngược (25 µM), 12 µL nước vô khuẩn và 1 µL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.
Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 µL nước vô khuẩn.
Bảng 1 – Mồi đặc hiệu và tiêu chuẩn chấp nhận tương ứng
| Chủng | Mồi đặc hiệu | Trình tự mồi | Tiêu chuẩn chấp nhận* |
| La-14 | 1 | Mồi xuôi (5′-3′)
AAACTGCAATTTAAGATTAT GAGTTTC Mồi ngược (5′-3′) GGTACCGTCTTGATTATTAGTGTA Nhiệt độ bắt cặp của mồi: 51,0 °C |
Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 184 cặp base. Không được có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 600 cặp base. |
| NCFM | 1 | Mồi xuôi (5′-3′)
TCGGCAAACTTAGTTGCAGAAGG Mồi ngược (5′-3′) GGTGCTAAGCTAGGTATGGAAC. Nhiệt độ bắt cặp của mồi: 57,0 °C |
Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 365 cặp base với 2 đa hình đơn nucleotid (SNP: Single-nucleotid polymorphisim). Vị trí SNP đầu tiên được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 15 cặp base có trình tự như sau GAGTAAATTCCATCA, vị trí của SNP này là cặp base thứ 50 tính từ đầu 5′ của mồi xuôi. Vị trí SNP thứ hai được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 15 cặp base có trình tự như sau: TTCAATTGAAGTTTG, vị trí của SNP này là cặp base thứ 242 tính từ đầu 5′ của mồi xuôi. Trình tự của sản phẩm khuếch đại gen nên được xác định bằng các kỹ thuật giải trình tự đã được thẩm định, ví dụ như phương pháp Sanger. |
| 2 | Mồi xuôi (5′-3′)
GCTGACGGAGATTATTCAAGCCA Mồi ngược (5′-3′) GCAGAACACATACGCTACCAGA. Nhiệt độ bắt cặp của mồi: 57,0 °C |
Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 433 cặp base với hai SNP. Vị trí SNP đầu tiên được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 15 cặp base có trình tự như sau: AAGCATTCAATACAC và vị trí SNP này là cặp base thứ 72 tính từ đầu 5′ của mồi xuôi. Vị trí SNP thứ hai được gạch chân trong đoạn polynucleotid có 15 cặp base có trình tự như sau ATATGGTTCTT
ACCT và vị trí SNP này là cặp base thứ 215 tính từ đầu 5′ của mồi xuôi. Trình tự của sản phẩm khuếch đại gen nên được xác định bằng các kỹ thuật giải trình tự đã được thẩm định, ví dụ như phương pháp Sanger. |
|
| 3 | Mồi xuôi (5′-3′)
AAACTGCAATTTAAGATTATGAGTTTC Mồi ngược (5′-3′) GGTACCGTCTTGATTATTAGTGT Nhiệt độ bắt cặp của mồi: 51,0 °C |
Sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 600 cặp base. Không được có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 184 cặp base |
* Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng (strain).
Mẫu chứng dương: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 µL khuôn DNA của chúng chuẩn Lactobacillus acidophilus La-14/NCFM hoặc thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng chuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus.
Tiến hành: Đối với mỗi cặp mồi, tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương trên cùng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp ở Bảng 2. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chúng Lactobacillus acidophilus La-14/NCFM bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.
Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2% trong dung dịch đệm TAE IX (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL hoặc thuốc nhuộm gel phù hợp khác và rửa gel bằng nước.
Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xửlý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.
Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước của các sản phẩm khuyếch đại, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên gel.
Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như được quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus làm chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.
Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.
Định lượng
Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus acidophilus không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.
Giới hạn nhiễm vi sinh vật
Tổng số nấm: Không được quá 102 CFU/g (Phụ lục 13.6). Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không được quá 5 × 103 CFU/g (Phụ lục 1.26).
Vi sinh vật gây bệnh
Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).
Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).
Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).
Bảng 2 – Chu trình nhiệt
| Chủng | Cặp mồi | Chu trình khuếch đại PCR |
| La-14 | 1 | Bước 1: ủ 95 °C trong 7 min.
Bước 2: ủ 95 °C trong 30 s. Bước 3: ủ ở 51,0 °C trong 30 s. Bước 4: ủ ở 72 °C trong 60 s. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ, sau đó ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
| NCFM | 1 | Bước 1: ủ 95 °C trong 7 min.
Bước 2: ủ 95 °C trong 30 s. Bước 3: ủ ở 57,0 °C trong 30 s. Bước 4: ủ ở 72 °C trong 30 s. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ, sau đó ủ tiếp ở 72°C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
| 2 | Bước 1: ủ 95 °C trong 7 min.
Bước 2: ủ 95 °C trong 30 s. Bước 3: ủ ở 57,0 °C trong 30 s. Bước 4: ủ ở 72 °C trong 30 s. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ, sau đó ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
|
| 3 | Bước 1: ủ 95 °C trong 7 min.
Bước 2: ủ 95 °C trong 30 s. Bước 3: ủ 51,0 °C trong 30 s. Bước 4: ủ 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ, sau đó ủ tiếp ở 72°C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
Bảo quản
Bảo quản trong bao bì có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.
Ghi nhãn
Phải ghi tên chi, loài, chủng và số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương trên nhãn.
Ghi chú
1 AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.
Tài liệu tham khảo
Dược Điển Việt Nam 6 – phiên bản mới nhất của Dược Điển Việt Nam do Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 3960/QĐ-BYT ngày 26/12/2025. Trang 1751-1752, tải PDF tại đây