BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUBSP. INFANTIS
BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUBSP. INFANTIS
Bifidobacterium longum subsp. infantis
Định nghĩa
Bifidobacterium longum subsp. infantis là vi khuẩn kị khí, Gram dương, không sinh bào tử, sinh acid lactic, lên men dị hình hexose tùy ý. Chúng có hình dạng khác nhau như trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy; trực khuẩn hình que chia nhánh hình chữ Y. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau quá trình lên men trước khi tiến hành đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. infantis không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.
Chủng Bi-26: Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 (ATCC SD-6720) là chủng vi khuẩn đặc trưng, thuần chủng, không sinh D-lactat thuộc loài Bifidobacterium longum subsp. infantis.
Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chúng Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26.
Định tính
A. Định tính bằng kính hiển vi.
Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.
Tiêu chuẩn chấp nhận: trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy và trực khuẩn hình que chia nhánh hình chữ Y.
B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.
Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TE 1X, dung dịch đệm TAE 1X: Xem Phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.
Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotics trong dung dịch đệm TE IX (TT) có nồng độ 100 mg/ml.
Cặp mồi 1:
Mồi xuôi (5′-3′) GTCACGATGTCTCCTTTGATATCAGCATG và mồi ngược (5′-3) CCTTTTGCGTCTCCCCCG. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 µM bằng dung dịch đệm TE IX (TT), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 µM bằng dung dịch đệm TE IX (TT), bảo quản ở -20 °C.
Cặp mồi 2:
Mồi xuôi (5′-3′) TCGCCGACATGCGAGACGAA và mồi ngược (5′-3′) TCCAGGCTCAGCGTGCGA. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 µM bằng dung dịch đệm TE IX (TT), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 µM bằng dung dịch đệm TE IX (TT), bảo quản ở -20 °C.
Mẫu thử. Đối với mỗi cặp mồi đặc hiệu, chuẩn bị dịch chứa 12 µL PCR master mix1, 1 µL dung dịch mồi xuôi (25 µM), 1 µL dung dịch mồi ngược (25 µM), 10 µL nước vô khuẩn và 1 µL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.
Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 µL hỗn dịch mẫu bằng 1 µL nước vô khuẩn.
Mẫu chứng dương: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 µL hỗn dịch mẫu bằng 1 µl dung dịch DNA của chủng đối chiếu Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 hoặc thay thế cặp mồi đặc hiệu cho chủng đối chiếu bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. Infantis.
Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt ghi trong Bảng 1. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. infantis thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.
Bảng 1 – Chu trình nhiệt
| Cặp mồi đặc hiệu | Chu trình nhiệt |
| Cặp mồi 1 | Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 7 min;
Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 59 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
| Cặp mồi 2 | Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 7 min;
Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 61 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 – 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. |
Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose 2% (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và rửa gel bằng nước. Có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.
Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.
Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.
Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Trong trường hợp mẫu chứng dương sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố. Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại gen nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, cần tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.
Tiêu chuẩn chấp nhận:
Cặp mồi 1: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 105 cặp base.
Cặp mồi 2: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 181 cặp base.
Định lượng
Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium ngoại trừ một số thay đổi sau.
Môi trường thạch MRS Lactobacilli: Chuẩn bị môi trường có công thức chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26 và thêm 1 ml dung dịch vô khuẩn cystein hydroclorid (TT) 5% (kl/tt) vào 100 ml môi trường ngay trước khi sử dụng.
Dung dịch đệm pepton: Thành phần như trong Bảng 2 hoặc có thể sử dụng dung dịch thương phẩm có sẵn.
Bảng 2 – Dung dịch đệm pepton
| Thành phần | Khối lượng |
| Pepton | 10,0 g |
| Natri clorid | 5,0 g |
| Dinatri hydrophosphat, khan | 1,9 g |
| Kali dihydrophosphat | 1,5 g |
| Dung dịch sau khi pha có pH 7,2 ± 0,2 | |
Hòa các thành phần trên trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng. Đun sôi trong không quá 1 min để hóa chất hòa tan hoàn toàn và có thể phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C. Nên để dung dịch đệm đến nhiệt độ phòng trước khi dùng.
Chuẩn bị hỗn dịch mẫu: Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, thay thế môi trường lỏng MRS Lactobacilli bằng dung dịch đệm pepton.
Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. infantis không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.
Giới hạn nhiễm vi sinh vật
Tổng số nấm: Không được quá 102 CFU/g (Phụ lục 13.6).
Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không được quá 5 × 103 CFU/g (Phụ lục 1.26).
Vi sinh vật gây bệnh
Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).
Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).
Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).
Bảo quản
Bảo quản trong bao bì có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.
Ghi nhãn
Phải ghi đầy đủ tên chi, loài và chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương.
Ghi chú
1 AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.
Tài liệu tham khảo
Dược Điển Việt Nam 6 – phiên bản mới nhất của Dược Điển Việt Nam do Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 3960/QĐ-BYT ngày 26/12/2025. Trang 1744-1746, tải PDF tại đây