XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT LIÊN QUAN TẠP A CỦA FENOFIBRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

NGUYỄN THỊ HỒNG, VŨ HÀ KHUÊ, NGUYỄN THỊ LIÊN*

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

1. Đặt vấn đề

Fenofibrat là một dẫn chất của acid fibric, có tác dụng hạ lipid máu (gồm cholesterol và triglycerid), ngoài ra còn có tác dụng làm giảm acid uric máu do làm tăng đào thải acid uric qua nước tiểu. Thuốc được chỉ định sử dụng trong điều trị tăng lipid máu, bao gồm cả bệnh nhân bị tăng huyết áp hay bị tiểu đường có kèm tăng lipid máu [1]. Đây là những bệnh mãn tính có thời

gian sử dụng kéo dài, vì vậy việc kiểm soát chất lượng thuốc, đặc biệt là kiểm soát các tạp chất rất quan trọng nhằm hạn chế các độc tính do các tạp chất gây ra. Tạp A của fenofibrat, [(4-chlorophenyl)(4-hydroxyphenyl) methanon], là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp fenofibrat.

Để kiểm soát chất lượng của nguyên liệu cũng như các chế phẩm chứa hoạt chất fenofibrat, bên cạnh chất chuẩn fenofibrat, Dược điển Anh, Dược điển Việt Nam, Dược điển Mỹ, Dược điển Châu u qui định sử dụng các chất chuẩn tạp của fenofibrat, trong đó có tạp A của fenofibrat để đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký và làm chất đối chiếu để định lượng tạp A của fenofibrat trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc.

Nhằm góp phần nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đông, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và thẩm định qui trình xác định tạp chất liên quan (4-chlorophenyl) (4-hydroxyphenyl)methanon (tạp A của fenofibrat) phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2. Thực nghiệm

2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ đã được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC 17025 và GLP: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu; cột phân tích: C18 (100 x 4,6 mm; 3,5 μm); cân phân tích Mettler MS105; cân phân tích Mettler XPE26; Máy đo pH Metrohm; các thiết bị, dụng cụ khác: máy lắc siêu âm, các dụng cụ thủy tinh chính xác class A.

2.1.2. Hóa chất, chất chuẩn

Methanol, acetonitril, acid phosphoric: đạt tiêu chuẩn HPLC và PA.

(4-chlorophenyl)(4-methoxyphenyl)methanon: là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp tạp Acủa fenofibrat, đươc tổng hợp từ anisol và p- clorobenzoyl clorid.

Chất chuẩn:

+ Fenofibrat releated compound A USPRS lot: F0F021, hàm lượng 100 %

+ Fenofibrat releated compound B USPRS lot: F0F022, hàm lượng 100 %

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu

(4-chlorophenyl)(4-hydroxyphenyl)methanon (tạp A của fenofbrat), được tổng hợp và tinh chế từ hợp chất anisol.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Điều kiện sắc ký

Dựa trên các tài liệu tham khảo Dược điển Anh 2020, Dược điển Châu u 9.2, Dược điển Việt Nam V, Dược điển Mỹ 41, COA chuẩn tạp A của fenofibrat (Mikromol) [7] và các trang thiết bị có sẵn, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ pha động, cột sắc ký, khảo sát bước sóng… nhóm nghiên cứu đã lựa chọn được điều kiện sắc ký như sau:

– Cột: C18 (100 x 4,6 mm; 3,5 μm);

• Detector: UV, đặt ở bước sóng 210 nm;
• Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
• Thể tích tiêm: 10 μl.
• Thời gian chạy: 5 lần thời gian lưu của pic tạp A của
• Pha động: Nước được điều chỉnh pH 2,5 với acid phosphoric loãng – acetonitril (55 : 45)
• Dung môi pha mẫu: Methanol

2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu

• Mẫu trắng: Methanol
• Dung dịch thử: Dung dịch tạp chất A của fenofibrat 0,5 mg/ml trong methanol.

– Dung dịch chuẩn: Dung dịch tạp chất A chuẩn của fenofibrat 0,5 mg/ml trong methanol.

• Dung dịch tạp chất B của fenofibrat: Dung dịch tạp chất B chuẩn của fenofibrat 0,05 mg/ml trong methanol
• Dung dịch (4-clophenyl-4-methoxyphenyl) methanon: Dung dịch (4-clophenyl-4-methoxyphenyl) methanon 0,05 mg/ml trong methanol
• Dung dịch Spike: Cân chính xác khoảng 25 mg nguyên liệu tạp chất A của fenofibrat vào bình định mức 50 ml; thêm 5,0 ml mỗi dung dịch tạp chất B của fenofibrat và dung dịch (4-clophenyl-4-methoxyphenyl) methanon, hòa tan và pha loãng với methanol vừa đủ đến vạch.
• Dung dịch đối chiếu: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thử, pha loãng thành 100,0 ml với methanol.
• Dung dịch kiểm tra hệ thống: Cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn tạp chất B của fenofibrat và 1 mg chuẩn tạp chất A của fenofibrat, hòa tan và pha loãng thành 20,0 ml với

* Các dung dịch phân hủy đánh giá độ đặc hiệu:

• Phân hủy bởi tia UV: Dung dịch tạp chất A của fenofibrat 0,5 mg/ml trong methanol, đem phân hủy dưới ánh sáng UV trong 24 giờ.
• Phân hủy bởi nhiệt độ: Dung dịch tạp chất A của fenofibrat 0,5 mg/ml trong methanol, đun cách thủy ở 80 oC trong 120 phút.
• Phân hủy trong môi trường kiềm: Cân chính xác khoảng 25 mg nguyên liệu tạp chất A của fenofibrat, hòa tan và pha loãng trong methanol thành 50 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1 N, để trong 60 phút.

• Phân hủy trong môi trường acid: Cân chính xác khoảng 25 mg nguyên liệu tạp chất A của fenofibrat, hòa tan và pha loãng trong methanol thành 50 ml, thêm vào 1ml HCl 0,1N, để trong 60 phút.
• Phân hủy bởi tác nhân oxy hóa: Cân chính xác khoảng 25 mg nguyên liệu tạp chất A của fenofibrat, hòa tan và pha loãng trong methanol thành 50 ml, thêm vào 1ml H2O2 3 %, để trong 60 phút.

Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với Dung dịch kiểm tra hệ thống, thứ tự rửa giải của hai pic lần lượt là tạp A của fenofibrat, tạp B của fenofibrat; hệ số phân giải giữa hai pic không được nhỏ hơn 3,0.

Tiêm 10 µl các dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu, dung dịch tạp B của fenofibrat, dung dịch (4-clophenyl-4-methoxyphenyl)methanon, dung dịch kiểm tra hệ thống, dung dịch Spike và các dung dịch phân hủy vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng của pic chính trong các dung dịch trên.

Do (4-clophenyl-4-hydroxyphenyl)methanon (tạp A của fenofibrat), được tổng hợp và tinh chế từ hợp chất anisol và 4-clorobenzoyl clorid, với sản phẩm trung gian là (4-clophenyl-4-methoxyphenyl)methanon, nên (4-clophenyl-4-methoxyphenyl)methanon được thêm vào trong dung dịch Spike để đánh giá khả năng tách các pic tạp ra khỏi pic chính của hệ thống. Do (4-clophenyl- 4-hydroxyphenyl)methanon (tạp A của fenofibrat) có gốc OH phenol, là nhóm chức rất dễ bị tác động của các yếu tố môi trường bên ngoài: ánh sáng, nhiệt độ, các tác nhân oxy hóa, acid hay base, do đó chúng tôi tiến hành đánh giá độ đặc hiệu trong các điều kiện phân hủy khắc nghiệt.

2.2.3. Giới hạn tạp chất

– Trên SKĐ thu được từ dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào, ngoài pic chính, không được lớn hơn diện tích pic chính trong dung dịch đối chiếu (1,0 %).

– Tổng diện tích của các pic phụ, ngoài pic chính, không được lớn hơn 2 lần diện tích pic chính trong dung dịch đối chiếu (2,0 %).

Đối với các tạp chuẩn dùng trong các phép thử HPLC và GC, độ tinh khiết yêu cầu ≥ 95 % [6]. Trong đề tài tổng hợp tạp A của fenofibrat chúng tôi đang nghiên cứu, mục tiêu tổng hợp được tạp A của fenofibrat có độ tinh khiết ≥ 98 %, do đó chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn tạp: mỗi tạp ≤ 1,0 %, tổng tạp ≤ 2,0 %.

2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp xác định giới hạn tạp chất theo hướng dẫn “validation of analytical procedures: Text and methodology Q2(R1)” của ICH 2005 với các tiêu chí: Độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại [5].

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, thử, dung dịch tạp B của fenofibrat, dung dịch (4-clophenyl-4- methoxyphenyl)methanon, dung dịch Spike, các dung dịch phân hủy đã được xây dựng theo mục 2.2.1; sắc ký đồ thu được của các dung dịch thể hiện ở hình 1. Thứ tự rửa giải của các pic được xác định bằng cách tiêm dung dịch chuẩn đơn của từng chất, lần lượt là tạp A của fenofibrat, tạp B của fenofibrat, (4-clophenyl-4- methoxyphenyl)methanon; sắc ký đồ cho thấy các pic tách rõ ràng, đối xứng và gọn. Như vậy việc lựa chọn các điều kiện sắc ký là phù hợp.

3.2. Đánh giá phương pháp

3.2.1. Độ đặc hiệu

Tiêm lần lượt các dung dịch như sau: Mẫu trắng, dung dịch chuẩn tạp A của fenofibrat, dung dịch thử, dung dịch tạp B của fenofibrat, dung dịch (4-clophenyl) (4-methoxyphenyl)methanon, dung dịch Spike và các dung dịch phân hủy vào hệ thống sắc ký. Trên sắc ký đồ thu được từ chương trình sắc ký, pic mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic tạp A của fenofibrat thu được từ dung dịch chuẩn, dung dịch thử tạp A của fenofibrat có thời gian lưu (khoảng 5,37 phút) tương ứng với pic tạp A của fenofibrat trong dung dịch chuẩn (khoảng 5,31 phút), pic chính trên SKĐ của dung dịch tạp B của fenofibrat có thời gian lưu 9,43 phút, pic chính trên SKĐ của dung dịch (4-clophenyl) (4-methoxyphenyl)methanon có thời gian lưu 15,76 phút. Các pic trong dung dịch Spike tách rõ ràng; trên SKĐ của các dung dịch phân hủy, các pic tạp tách hoàn toàn ra khỏi pic chính, pic chính đạt yêu cầu về độ tinh khiết. Quét phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử với detector UV cho thấy, quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của hoạt chất thu được từ dung dịch thử phù hợp với quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của pic chính thu được từ dung dịch chuẩn tương ứng, hệ số chồng phổ giữa chuẩn và thử bằng 0,999059. Độ tinh khiết của pic chính trên SKĐ dung dịch thử bằng 0,999988 (hình 1)

Mẫu trắng	Mẫu chuẩn
Mẫu thử	(4-chlorophenyl)(4-methoxyphenyl)methanon
Tạp chất B của fenofibrat	Mẫu Spike
Mẫu thử phân hủy bởi UV	SKĐ dung dịch kiểm tra hệ thống
Chồng phổ pic chuẩn – thử	Độ tinh khiết của mẫu thử

Với các điều kiện sắc ký như trên và từ các kết quả thu được đã chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu.

3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và dung dịch kiểm tra hệ thống. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng pic (T) và độ phân giải giữa 2 pic (R) trong dung dịch kiểm tra hệ thống.

Kết quả:

• Độ phân giải giữa 2 pic tạp A của fenofibrat và tạp B của fenofibrat trên sắc ký đồ dung dịch kiểm tra hệ thống là 10,9 > 3,0.
• Các giá trị T, N, tR và diện tích pic của 6 lần tiêm dung dịch đối chiếu đều đạt yêu cầu (0,8 < T = 1,168, 1,5; N = 4794 > 1500; RSDS= 0,17 % < 2,0 %; RSDTr = 0,12 % < 1,0 %). Quy trình thử đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống.

3.2.3. Độ tuyến tính

Từ dung dịch chuẩn gốc tạp A của fenofibrat (5,154 mg/10,0 ml methanol ~ 0,5154 mg/ml), pha loãng thành các dung dich tạp A của fenofibrat có các nồng độ khoảng 20; 10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1 và 0,05 µg/ ml trong methanol tương ứng với 400 %; 200 %; 100 %; 50%; 20 %; 10 %; 5 %; 2 % và 1 % nồng độ giới hạn mỗi tạp, với giới hạn cho phép của mỗi tạp ≤ 1,0 % (tương ứng với nồng độ 5 μg/ml).

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng của pic. Kết quả thể hiện ở hình sau:

Phương trình hồi quy: y = 45465x + 421 Hệ số tương quan r = 1,0000

Hệ số chắn Y = 0,18 %

Kết quả khảo sát cho thấy trong khoảng nồng độ từ 0,05 µg/ml đến 20 µg/ml (400 % so với nồng độ giới hạn mỗi tạp), có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic, hệ số tương quan r = 1,0000, phần trăm hệ số chắn tại nồng độ 100 % là 0,18 % < 5,0 %

3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Từ kết quả khảo sát độ tuyến tính, tiến hành phân tích thống kê ANOVA với độ tin cậy 95 % cho kết quả như sau: độ lệch chuẩn số dư σ = 427,4; độ dốc đường chuẩn: 45465, giá trị LOD và LOQ như sau:

LOD = (3,3 x 427,4)/45465 = 0,031 (µg/ml); LOQ = LOQ = 3x LOD = 0,093 (µg/ml)

Thực nghiệm xác nhận sự phù hợp các giá trị LOD và LOQ:

• Dung dịch LOD: Cân 6,216 mg chuẩn tạp chất A của fenofibrat vào bình định mức 20 ml. Hòa tan và thêm vừa đủ với methanol. Hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng với methanol vừa đủ 100 ml. Tiếp tục hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng 0,45 µm.
• Dung dịch LOQ: Cân 6,216 mg chuẩn tạp chất A của fenofibrat vào bình định mức 20 ml. Hòa tan và thêm vừa đủ với methanol. Hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng với methanol vừa đủ 100 ml. Tiếp tục hút chính xác 3,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng 0,45 µm.

Nhận xét: Giá trị LOD, LOQ có nồng độ rất nhỏ so với nồng độ giới hạn mỗi tạp (1 %; ≈ 5 µg/ml); tỷ số tín hiệu /nhiễu (S/N) của dung dịch LOD 3,75 (>3); độ lặp lại của pic hoạt chất trong dung dịch LOQ: 1,08 % (< 10,0 %), tỷ số tín hiệu /nhiễu (S/N) của dung dịch LOQ 11,1 (>10). Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

3.2.5. Độ lặp lại

Khảo sát trên 6 dung dịch thử, với các điều kiện sắc ký như đã chọn trong mục 2.2.1. Kết quả được ghi trong Bảng 1.

Bảng 1. Kết quả thẩm định độ lặp lại

Mô tả	Thử 1		Thử 2		Thử 3		Thử 4		Thử 5		Thử 6
Lượng cân (mg)	25,06		25,12		25,09		25,17		25,07		25,05		HL tạp trung bình (%)
TB diện tích pic dung dịch đối chiếu	241745		235148		235877		233729		235962		236544
		% tạp		% tạp		% tạp		% tạp		% tạp		% tạp
TR tạp (Phút)	S tạp (mAU)		S tạp (mAU)		S tạp (mAU)		S tạp (mAU)		S tạp (mAU)		S tạp (mAU)
3,13	–	–	–	–	1584	0,007	1493	0,007	1165	0,005	1286	0,006	0,004
3,48	3468	0,015	3321	0,014	3805	0,016	3735	0,016	3407	0,015	3498	0,015	0,015
8,06	–	–	–	–	1280	0,005	–	–	2106	0,009	2266	0,010	0,004
8,66	4593	0,020	2807	0,012	3050	0,013	2691	0,012	–	–	–	–	0,009
10,09	3272	0,014	3444	0,015	2081	0,009	2314	0,010	2024	0,009	2129	0,009	0,011
20,59	100277	0,430	103122	0,440	101327	0,430	91958	0,404	91075	0,401	92156	0,396	0,417
Tổng tạp (%)	0,48		0,48		0,48		0,45		0,44		0,44		0,46

Kết quả phân tích cho thấy, lô nguyên liệu tạp A của fenofibrat xuất hiện 06 tạp, hàm lượng mỗi tạp < 1,0 %, tổng các tạp < 2,0 %; % RSD của tổng tạp: 4,70 (< 5,0 %). Do đó phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại.

4. Kết luận

Qua khảo nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng được quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan của nguyên liệu tạp A của fenofibrat bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu

năng cao trên cột pha đảo với pha động nước được điều chỉnh pH 2,5 bằng acid phosphoric – acetonitril (55 : 45). Phương pháp sử dụng cột C18 (100 x 4,6 mm, 3,5 µm); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 10 µl; detector 210 nm. Phương pháp đã được áp dụng để xác định tạp chất liên quan của lô nguyên liệu tạp A của fenofibrat đã tổng hợp được. Kết quả đã xác định được 06 tạp ≤ 0,42%, tổng tạp 0,46 %, đạt yêu cầu về giới hạn của tạp chất liên quan của nguyên liệu tạp A của fenofibrat.

Tài liệu tham khảo

1. Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt nam, Lần xuất bản thứ hai, Nhà xuất bản Y học, 652 – 653.
2. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam, Lần xuất bản thứ năm, Nhà xuất bản Y học.
3. The British Pharmacopeial Comvention (2020), British
4. The United States Pharmacopeial convention (2020), United states Pharmacopoeia
5. ICH (2005), “validation of analytical procedures: Text and methodology Q2(R1)”, ICH Harmonized Tripartite guidelines, 1-13.
6. WHO (2007) “General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances”, Annex 3, Pg.66 – 67.
7. LGC Standards (2021), (4-Chlorophenyl)(4-hydroxyphenyl)methanone, https://www.lgcstandards.com/FR/en/-4- Chlorophenyl-4-hydroxyphenyl-methanone/p/MM0505.01-0025.