Tổng quan về phương pháp Điện di mao quản

Điện di mao quản đã được hình thành từ năm 1930 bởi nhà khoa học Arnes Tiselius. Nhưng phải đến năm 1981, có sở của phương pháp này mới được Jorgenson và Lukacs đưa ra rộng rãi. Và cho đến ngày nay, phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu khoa học. Bài viết của nhà thuốc Ngọc Anh sẽ đem đến cho bạn đọc những thông tin cụ thể về phương pháp này.

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) là gì?

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật phân tích được thực hiện trong một ống thủy tinh có đường kính mỏng để phân tách các phân tử và ion dựa trên tính linh động của chúng dưới ảnh hưởng của điện áp đặt vào. Trong kỹ thuật này, một hỗn hợp các phân tử và ion được phân tách dựa trên điện tích và kích thước của chúng.

Thuật ngữ điện di mao quản bao gồm hai thuật ngữ: mao quản và điện di. Ống mao dẫn dùng để chỉ một ống thủy tinh rất mỏng có đường kính dưới milimet. Điện di là một kỹ thuật phân tách để sắp xếp nhóm các ion dựa trên kích thước và điện tích của chúng bằng cách sử dụng dòng điện. Hệ thống điện di bao gồm hai điện cực, một bộ đệm như một vật mang hoặc phương tiện cho các ion, và một nguồn điện.

Cực dương và cực âm tạo thành hai điện cực lần lượt biểu thị điện cực dương và điện cực âm. Các phân tử sẽ được tách ra có thể là các ion mang điện tích dương, các ion mang điện tích âm hoặc trung tính mà không có bất kỳ điện tích nào. Các phân tử và ion trung hòa có độ linh động khác nhau khi có dòng điện bên ngoài tác dụng. Các ion dương di chuyển về phía cực âm và các ion âm về phía cực dương trong khi các phân tử trung hòa không chuyển động dưới tác dụng của dòng điện. Do đó, điện di mao quản là kỹ thuật thực hiện điện di trong các ống mao quản chứa đầy đệm, qua đó điện áp cao được áp dụng để đạt được sự phân tách các phân tử.

Điện di mao quản hoạt động như thế nào?

Hệ thống điện di được thực hiện bằng cách sử dụng một ống mao dẫn được gọi là điện di mao quản. Máy điện di mao quản hoạt động bằng cách sử dụng một ống mao dẫn thủy tinh hình chữ U được mở ở cả hai đầu. Hai đầu của ống mao dẫn được đặt vào hai bình chứa đệm và một trong các điện cực. Đầu ống mao dẫn được nhúng trong bộ đệm với cực dương hoạt động như một catot với cực âm hoạt động như anot của hệ thống điện di.

Thành ống mao dẫn có điện tích âm và các ion dương trong đệm bị hút và trung hòa nó. Điều này tạo thành lớp điện kép trên toàn bộ bề mặt thành của ống mao dẫn. Một lớp cation đệm (ion dương) phủ lên thành ống mao dẫn. Điều này cho phép các phân tử chảy đều qua giữa ống tạo ra dòng điện thẩm (EOF). EOF là dòng chất lỏng tiếp xúc với bề mặt rắn tích điện do điện trường đặt vào.

Bộ đệm được sử dụng ở đây có điện tích dương. Khi có điện, nó chuyển động từ cực dương sang cực âm kéo theo các phân tử cùng với nó. Do đó, đệm hoạt động như một phương tiện vận chuyển các phân tử trong quá trình điện di mao quản. Các điều kiện trong điện di mao quản được tạo ra theo cách mà các phân tử được tách ra. Sẽ di chuyển từ cực dương sang cực âm cùng với chuyển động của bộ đệm khi dòng điện được đưa vào. Một điện áp cao đến 30 kV và một điện trường lớn được đặt qua ống mao dẫn trong điện di mao quản.

Các loại điện di mao quản thường dùng

Ngày nay, điện di mao quản gồm có 6 loại khác nhau bao gồm:

• Capillary zone electrophoresis hay còn gọi là điện di mao quản vùng. Đối với loại điện di mao quản này, thông qua sự khác biệt giữa linh độ của các yếu tố có trong dung dịch thử cũng như mẫu thử thì quá trình tách sẽ được kiểm soát. Linh độ ở đây chính là hàm số giữa kích thước cũng như điện tích của chất được dùng phân tích.
• Micellar electrokinetic chromatography hay còn gọi là sắc ký mixen điện động. Ở loại này thì dung dịch sẽ được thêm vào một chất là chất hoạt động bề mặt. Làm sao cho nồng độ mixen tới hạn sẽ thấp hơn so với nồng độ làm việc. Trong pha tĩnh giả được tạo thành bởi mixen, các chất phân tích sẽ được phân bố vào đây. Kỹ thuật này sẽ ứng dụng đối với các trường hợp phân tích chất thử là các ion hay là chất trung tính.
• Capillary gel electrophoresis hay còn gọi là điện di mao quản gel. Kỹ thuật này sẽ dùng một loại mao quản có chứa gel. Ứng dụng chủ yếu để tách các chất là protein hay oligomer cũng như là các peptit. Gel thì có ưu điểm là làm cho dòng điện thậm bị giảm đi. Bên cạnh đó sự hấp phụ protein vào trong mao quản cũng thấp xuống. Từ đó mà pic sẽ có hiệu ứng bất đối được giảm đáng kể.
• Capillary isoelectric focusing hay được gọi là điện di mao quản hội tụ đẳng điện. Nguyên lý tách ở đây là dựa vào sự không giống nhau giữa các điểm đẳng điện. pH sẽ được biến đổi để có thể tạo ra được các vùng mẫu thử có trạng thái ổn định. Việc biến đổi pH được thực hiện thông qua con đường đặt thế vào trong mao quản. Trong mao quản đó đã chứa sẵn các chất là những chất lưỡng cực có pI khác nhau.
• Capillary isotachophoresis hay còn gọi là điện di mao quản đẳng tốc. Trong kỹ thuật CITP có sử dụng hai đêm khác nhau để bao xung quanh chất cần được phân tích. Anion và cation sẽ được tạo ra các vùng khác nhau nhờ sự phân tách. Nồng độ của chất cần nghiên cứu sẽ có sự tương đương giữa các vùng. Mỗi vùng lại có chiều dài tương đương với lượng chất cần phân tách.

Trong sau loại này thì sắc ký mixen điện động (MEKC) cũng như là điện di mao quản (CZE) là hai kỹ thuật được ứng dụng nhiều nhất. Nguyên lý hoạt động của mỗi loại lại có sự khác nhau.

Nguyên lý của CZE

• Trong điện di mao quản vùng, các tiểu phân tích điện được tách thông qua nguyên lý của điện di cũng như điện thẩm.
• Linh độ điện di của ion được xác định thông qua công thức sau:

E_P = q/(6μηr)

Trong đó:

EP là linh độ điện di của ion.

là độ nhớt của dung dịch.

q là điện tích ion.

r là bán kính của ion.

• Tốc độ di chuyển được thể hiện qua công thức dưới đây:

V_EP = μ_EP (V/L)

Trong đó:

V là điện thế đặt.

VEP là tốc độ di chuyển (cm/s).

L là độ dài tổng của mao quản.

• Tốc độ của dòng điện thẩm (VEO) được xác định thông qua phương trình:

V_EO = μ_EO (V/L)

Trong đó: EO là linh độ của dòng điện thẩm.

• Thời gian để cho chất tan có thể đi được hết chiều dài hiệu dụng (l) của mao quản được tính theo phương trình:

t = l / E(π_EO + π_EP) = lL / V(π_EO + π_EP)

Với cường độ điện trường ở đây là E.

• Số đĩa lý thuyết được biểu diễn thông qua công thức:

N= (π_EO + π_EP) V / 2D

Với D là hệ số khuếch tán đối với chất hòa tan.

• Độ phân giải R khi 2 lần rửa giải kế tiếp của 2 chất hòa tan được thực hiện có công thức trong hình 1. Với EP, EP1 và EP2 là linh độ trung bình và riêng biệt của các chất được rửa giải liên tiếp.

Nguyên lý của MECK

• Ở loại này thì dung dịch sẽ được thêm vào một chất là chất hoạt động bề mặt. Làm sao cho nồng độ mixen tới hạn sẽ thấp hơn so với nồng độ làm việc.
• Đối với 1 hệ thống có mixen phù hợp thì đòi hỏi mixen phải đạt được các tiêu chí cụ thể. Đối với chất hoạt động bề mặt được thêm vào thì phải tan trong dung dịch đệm tốt. Dung dịch mixen phải có sự đồng nhất và trong suốt để detector UV có thể đi qua. Chất thường được thêm vào phổ biến là natri đoecyl sulfat, một số loại khác ít dùng hơn là muối mật hay cetyltrimethylammonium bromid. Hệ số dung lượng sẽ được điều chỉnh bằng cách cho dung môi hữu cơ và đệm.
• Các đồng phân đối quang dùng phương pháp này để tách khá phù hợp. Khi đó người ta sẽ cho thêm vào chất chiral hoặc là muối mật .
• Thực chất mixen không phải là một pha tĩnh thuần túy. Sắc ký cột ở đây cần phải được điều chỉnh dựa trên nguyên lý của MEKC.
• Thời gian lưu tR của chất trung tính được thể hiện qua biểu thức:

t_R = (1 + k’) t₀ / [1 + (t₀ / t_MC)]

Trong đó:

t0 là thời gian yêu cầu để chất không được lưu giữ có thể đi hết chiều dài hiệu dụng mao quản.

t_MC là thời gian cần thiết cho mixen đi được qua mao quản.

k’ là hệ số dung lượng.

t_R phải có giá trị trong khoảng t0 và tMC.

• k’ được xác định như sau:

k’ = (t_R / t₀ -1) / (1 – t_R / t_MC)

Trên thực tế thì k’ chỉ cần xác định bằng biểu thức tR / t0 -1. Với tR tương đương với thời gian từ khi tiêm mẫu cho đến khi có pic cao nhất. Còn t0 được xác định từ thời gian tiêm mẫu cho đến khi xuất hiện pic của dung môi. k’ là một số đặc trưng cho mỗi chất tan khác nhau.

• Độ phân giải RS khi thực hiện rửa giải 2 chất trung tính liên tiếp được thể hiện qua công thức trong hình 2: Với là độ chọn lọc được xác định thông qua tỉ lệ giữa k’2 và k’1.

Thiết bị điện di mao quản

Ống mao dẫn được tạo thành từ silica nung chảy, có đường kính trong từ 20-100 µm. Một điện trường cao áp được cung cấp vào hai đầu ống mao dẫn. Các điện cực được nối với hai đầu của ống mao dẫn thông qua dung dịch điện phân hoặc dung dịch đệm.

Ống mao dẫn chứa đầy chất lỏng dẫn điện ở độ pH nhất định. Ngoài máy dò và các thiết bị đầu ra khác, người ta còn dùng thêm một loại thiết bị có khả năng kiểm soát nhiệt độ. Do vậy mà đảm bảo kết quả có thể lặp lại. Mẫu được đưa vào mao quản bằng cách tiêm với hệ thống tiêm tự động. Thiết bị đo của hệ thống điện di mao quản được thể hiện trong hình.

Mao quản và cấu hình thiết bị

Mao quản được sử dụng thường được tạo thành từ silica nung chảy, lớp bên trong không có bao. Có một số thiết bị không đưa mao quản vào bên trong mà để cho nó tự do. Tuy nhiên trên thị trường chủ yếu là loại mao quản bỏ vào hộp chứa.

Để tương thích với một số loại cột thì người ta cũng đã tạo ra loại mao quản có bao bên trong. Lớp bao này sẽ giúp điều hướng cho dòng điện thẩm cũng như có khả năng làm cho mẫu được hấp phụ ít đi.

Tiêm mẫu

Có hai kiểu tiêm mẫu vào trong mao quản là tiêm áp suất âm dương và tiêm di chuyển điện. Đối với tiêm di chuyển điện thì được thực hiện bằng cách lấy điện cực và mao quản và nhúng vào trong lọ chứa mẫu. Đặt một điện thế cao lên trên lọ mẫu đó và kiểm soát thời gian, chỉ để thời gian ngắn.

Tiêm áp suất âm là cách tiêm cho vào đầu của mao quản có detector một áp suất âm. Sau đó dung dịch mẫu sẽ được đầu tiêm của mao quản hút vào. Còn cách tiêm áp suất dương là tạo cho lọ chứa mẫu một áp suất để mẫu có thể được đẩy vào trong mao quản. Cách này thường được áp dụng nhiều hơn bởi nó đem lại độ lặp tốt và đưa được nhiều thành phần của mẫu vào.

Nguồn điện

Trên thị trường hiện nay chủ yếu là các máy có nguồn điện 1 chiều. Điện thế được đảm bảo cung cấp từng nấc và có sự ổn định. Do vậy mà nền tạo ra tương đối phẳng.

Hơn nữa hệ thống này chỉ có thể tiêm mẫu theo anot hay catot chứ không đổi được vị trí của detector. Việc tiêm mẫu sẽ thực hiện hoặc tại anot, hoặc tại catot.

Detector

Hai detector thường được dùng trong hệ thống CE là detector huỳnh quang cảm ứng với laser hoặc detector UV. Ngoài ra một số máy lại có detector dãy diod hoặc là detector quét phổ UV.

Khi phân tích mẫu cần lưu ý gì?

Kích thước của mao quản

Độ phân giải của điện di có thể bị tác động bởi độ dài hay đường kính của mao quản. Nếu như mao quản dài thì sẽ làm cho thời gian để chất di chuyển hết tăng lên. Từ đó đó mà dòng điện giảm và độ phân giải tăng lên. Còn khi đường kích có sự tăng lên thì dòng điện tăng và độ phân giải bị giảm và ngược lại. Thường thì đường kính có giá trị cao hơn sẽ giúp tiêm vào trong một lượng mẫu lớn hơn. Từ đó mà tín hiệu nhiễu được cải thiện.

Tác động của điện thế

Nếu như trong hệ thống có hiệu điện thế cao thì sẽ khiến nhiệt độ tăng lên. Điều này gây ra bởi việc dung dịch đệm có 1 dòng điện đi qua. Tuy nhiên nhiệt độ này cần phải được kiểm soát bởi vì khi đó có sự thay đổi về tốc độ dòng điện thẩm cũng như linh độ của chất tan.

Tác động của lực ion

Khi mà kiểm soát được lực ion thì có thể điều chỉnh được nhiều yếu tố quan trọng. Như khi cho hiệu lực ion tăng lên thì các yếu tố như độ phân giải, hình dạng của pic hay hiệu lực cột sẽ được cải thiện đáng kể. Tuy nhiên cũng cần tăng vừa phải vì tăng quá mức cũng dẫn đến nhiệt độ tăng lên.

Tác động của pH

pH có sự tác động đối với dòng điện thẩm cũng như mức ion hóa của chất tan. Từ đó dẫn đến các chỉ số như độ nhạy, pic có hình dạng thay đổi. Trong một mao quản không có màng bao thì dòng điện thẩm tỉ lệ thuận với pH.

Thông số vận hành

Khi thực hiện vận hành máy điện di mao quản, phải tiến hành thực hiện thiết lập các thông số một cách tuần tự và hợp lý.

Thiết lập của máy

Xem thiết lập để có thể lựa chọn được cột phù hợp tách được chất phân tích. Ngoài ra cần nghiên cứu để pha được dung dịch đệm thích hợp. Chú ý khi dùng dung môi phải là loại tinh khiết và dùng riêng cho hệ thống CE.

Quá trình rửa mao quản

Thời gian và độ phân giải sẽ có sự ổn định nếu như thực hiện rửa giải theo đúng quy trình. Mỗi chuyên luận riêng lại có một quy trình được quy định cho phù hợp với chất cần phân tích. Thông thường người ta thường dùng H3PO4 có nồng độ 0,1M hoặc nước hay NaOH có nồng độ 0,1M.

Trước khi phân tích thì nên tiến hành rửa giải khoảng 5 lần. Khi có sự thay đổi về đệm cũng nên tiến hành rửa giải 5 lần. Nếu như dùng loại mao quản nung chảy không có màng bao thì nên dùng NaOH. Còn đối với loại mà có màng bao thì xử lý theo như nhà sản xuất hướng dẫn.

Phân tích mẫu

Để thu được kết quả đẹp, khi tiến hành lựa chọn các yếu tố như cách tiêm mẫu, cột cũng như là chất điện giải phải có sự phù hợp nhất. Có thể dùng đến nội chuẩn nếu như muốn tiêm mẫu được chính xác hơn. Tuy nhiên cũng cần lựa chọn nội chuẩn cho phù hợp với chất phân tích. Có thể cải thiện được hiệu quả nếu như chú ý thực hiện rửa giải sau mỗi lần tiêm hay thay đổi đệm. Chú ý tránh để nhiễm chéo mẫu, nếu như không may thì nên thực hiện rửa đầu tiêm. Đem đầu tiêm đó nhúng vào trong lọ đệm sau đó mới đưa vào mẫu.

Mỗi thông số vận hành sẽ được chuyên luận cụ thể quy định. Thiết bị lắp cho phù hợp với khoảng tuyến tính của detector về mặt động học. Độ di chuyển có thể cải thiện thông qua chất để pha loãng mẫu hay thêm chất điện giải vào. Tránh đưa lượng mẫu quá lớn vào cùng lúc vì có thể khiến cho cột quá tải.

Tính phù hợp của hệ thống

Có thể xác định thông qua việc đo các chỉ số như độ chọn lọc và hiệu lực, độ lặp lại cũng như là sự đối xứng pic. Thông số tiêu biểu để xem hệ thống có phù hợp hay không như độ lệch chuẩn tương đối RSD, độ nhạy, hệ số đối xứng T, hệ số dung lượng k’, số đĩa lý thuyết N, độ phân giải R và số đĩa lý thuyết trên 1 mét n.

Một pic lý tưởng là có sự đối xứng, không bị kéo đuôi hay có vai. Nếu có những hiện tượng sai lệch thì phải chỉnh lại các thông số cho phù hợp.

Dung dịch chuẩn nên được tiêm từ 5 lần trở lên. Giá trị RSD hợp lý thường không quá 3%.

Phân tích mẫu

Sau khi đã xác định được hệ thống đã chọn là phù hợp thì có thể tiến hành tiêm mẫu chuẩn và phân tích vào. Có thể tiêm xen kẽ nhau khi trong quá trình thực hiện.

Xử lý dữ liệu thu được

Để giảm sai số thì người ta thường chia diện tích pic thành các phân đoạn thời gian mà chất phân tích di chuyển.

Tắt hệ thống

Sau khi đã thực hiện xong thì bắt buộc phải rửa giải cột theo quy định. Nếu như có quy định từ nhà sản xuất thì nên thực hiện theo cách đó. Còn không thì có thể thực hiện theo chuyên luận.

Ứng dụng của Điện di mao quản

Phương pháp Điện di mao quản được sử dụng trong cả lĩnh vực dược hay công nghiệp. Nó dùng để xác định các chất phân tích khác nhau trong một loạt các chất nền mẫu. Điện di mao quản trong công nghiệp được sử dụng để phân tích các sản phẩm như. Có thể kể đến như phụ gia thực phẩm, thuốc diệt cỏ,chất tẩy rửa.

Còn trong dược phẩm thì nó được sử dụng kết hợp với HPLC để phân tích các chất có trong thuốc. Được sử dụng nhiều trong việc kiểm nghiệm và đánh giá dược phẩm.

Điện di mao quản so với Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

• CE có một dòng chảy phẳng, so với dòng chảy hình parabol được bơm của HPLC. Dòng chảy phẳng dẫn đến các đỉnh hẹp hơn và độ phân giải tốt hơn (hình).
• CE có công suất cực đại lớn hơn khi so sánh với HPLC. CE sử dụng hàng triệu đĩa lý thuyết.
• HPLC được phát triển kỹ lưỡng hơn và có nhiều pha di động và tĩnh có thể được thực hiện.
• HPLC có thiết bị đo phức tạp hơn, trong khi CE đơn giản hơn cho người vận hành.
• HPLC có rất nhiều loại chiều dài cột và cách đóng gói. Trong khi CE chỉ giới hạn ở các mao quản.
• Cả hai kỹ thuật đều sử dụng các phương thức phát hiện tương tự nhau.
• Có thể phối hợp với nhau để phân tích chất.

Nguồn tham khảo

1. Wallingford RA, Capillary electrophoresis, Advances in Chromatography (29) :1-76. Truy cập ngày 17/10/2022.
2. Manuel J. Gordon, CAPILLARY ELECTROPHORESIS, Science Vol. 242, No. 4876. Truy cập ngày 17/10/2022.
3. Paul D. Grossman, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice. Truy cập ngày 17/10/2022.
4. James P. Landers, Handbook of Capillary Electrophoresis. Truy cập ngày 17/10/2022.
5. Curtis A. Monnig, Capillary Electrophoresis. Truy cập ngày 17/10/2022.