Phương pháp sắc kí lớp mỏng và những ứng dụng trong thực tiễn

Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm. Ưu điểm là phương pháp này cho phép xác định nhanh thành phần của những hợp chất phức tạp. TLC có thể phân lập các chất ở hàm lượng rất nhỏ và thường sử dụng để phân tích các chất được chiết ra từ thực vật. Hãy cùng Nhà Thuốc Ngọc Anh tìm hiểu những thông tin về Sắc ký lớp mỏng trong bài viết sau đây.

Sắc ký lớp mỏng là gì?

Phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được 2 nhà bác học Nga Izmailov và Shraiber tìm ra từ năm 1938 nhưng đến 1958-1959, sau các công trình của E.Stahl được công bố thì nó mới được hoàn thiện, chuẩn hóa và được dùng rộng rãi.

Sắc kí lớp mỏng TLC là một kỹ thuật sắc ký. Trong đó pha tĩnh là chất hấp phụ trải thành lớp mỏng, mịn đồng nhất, được cố định trên phiến kim loại hoặc nhựa, phiến kính. Pha tĩnh hay được dùng là silica gel, cellulose hoặc aluminium oxide. Pha động là một hệ bao gồm một dung môi riêng lẻ hay hỗn hợp nhiều dung môi. Chúng phối hợp với nhau theo tỷ lệ được quy định và hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn. Dung dịch thí nghiệm được tách dựa trên tính phân cực của các thành phần khác nhau trong dung dịch.

Nguyên tắc hoạt động

Cũng giống như các kỹ thuật sắc ký khác, cơ chế chính của sắc ký lớp mỏng (TLC) phụ thuộc vào nguyên tắc phân tách. Sự phân tách phụ thuộc vào ái lực tương đối của các hợp chất đối với cả hai pha. Các hợp chất trong pha động di chuyển trên bề mặt của pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.

Trong khi di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử trong mẫu thử di chuyển trên lớp mỏng theo hướng của pha động với tốc độ khác nhau. Sự chuyển động xảy ra theo cơ chế các hợp chất có ái lực cao hơn với pha tĩnh di chuyển chậm. Trong khi các hợp chất có ái lực thấp di chuyển nhanh hơn. Do đó, sự phân tách của hỗn hợp đạt được, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đặc tính và bản chất của chúng được xác định bằng các kỹ thuật phát hiện phù hợp.

Mức độ di chuyển của chất phân tích có đại lượng đặc trưng của là hệ số di chuyển Rf. Hệ số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng di chuyển của chất thử và khoảng di chuyển của dung môi.

           Rf = a/b

Trong đó:

a (tính bằng cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử.

b (tính bằng cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi trên đường đi của vết.

Chú ý Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1.

Cách tiến hành

Dụng cụ

• Bình triển khai dung môi bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với bản mỏng và có nắp đậy kín.

• Ðèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và bước sóng 365 nm.
• Dụng cụ dùng để phun thuốc thử hiện .màu vết
• Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc dùng để sấy nóng một số phản ứng để phát hiện vết.

• Tủ hút để hút hơi độc.
• Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và dùng để chấm nhanh nhiều lần những dung dịch cần phân tích.

• Một máy ảnh thích hợp chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày.
• Các ống mao quản, Micropipet nhiều cỡ hoặc dụng cụ thích hợp.
• Bản mỏng đã được tráng sẵn chất hấp phụ  trên bề mặt.
• Trường hợp phòng thí nghiệm không có bản mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị các dụng cụ: Tấm kính phẳng kích thước phù hợp được xử lý trước, rửa sạch và sấy khô.

Chuẩn bị bản mỏng

• Ðiều chế chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel G, cellulose, nhôm oxyd. Trong số đó silicagel G được dùng thông dụng nhất. Sau khi trộn thành dịch, trải lên bản mỏng điều chỉnh độ dày phù hợp. Ðể các phiến kính nguyên tại chỗ đến khi mặt trên hết bóng, hoặc để khô qua đêm tại nhiệt độ phòng.
• Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô vào tủ sấy và đặt nhiệt độ 105 -110oC trong 30 phút (nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng). Lấy ra để nguội bảo quản trong bình hút ẩm.

Chuẩn bị bình khai triển

Các bình khai triển dung môi là bình thủy tinh dạng hình trụ hay hình hộp, nắp đậy kín. Sau khi pha dung môi pha động theo tỷ lệ quy định, cần tiến hành bão hòa dung môi. Bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong bình để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng cần căn chỉnh sao cho sau khi bão hòa còn một lớp dày khoảng 5mm đến 10mm đáy bình. Ðậy nắp bình kín và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 – 25 độ C. Nên dùng những dung môi thật tinh khiết dùng cho sắc ký để thu được kết quả chính xác.

Chấm chất phân tích lên bản mỏng

Lượng chất đưa lên bản mỏng ảnh hưởng lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá nhiều làm cho vết sắc ký to và kéo dài. Khi đó, vết các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lên nhau. Lượng chất nhỏ quá có thể sẽ không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ. Với dung dịch nồng độ loãng thì chấm nhiều lần cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần. Ðường xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5cm – 2 cm và cách bề mặt trên dung môi từ 0,8 – 1 cm. Các vết chấm nhỏ, đường kính 2 – 6 mm và cách nhau khoảng 15 mm. Các vết chấm ở các lần khác nhau càng trùng nhau càng tốt. Do đó, với những trường hợp phân tích phải dùng các mao quản định mức chính xác.

Triển khai sắc ký

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng trong bình triển khai. Vết chấm phải ở trên bề mặt lớp dung môi khai triển. Ðậy kín nắp bình, để nguyên nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã chạy trên bản mỏng đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra. Lúc này đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng. Tiếp theo hiện màu theo chỉ dẫn đã quy định trong chuyên luận riêng.

Đánh giá

Quan sát các vết sắc kí xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc tiến hành định tính, xác định tạp chất hoặc định lượng tùy theo quy định trong chuyên luận riêng.

Ứng dụng của sắc kí lớp mỏng

• Sắc kí lớp mỏng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa. Hay thử tinh khiết, bán định lượng hoặc định lượng các hoạt chất thuốc.

• TLC hữu ích trong phân tích Sinh hóa như tách hoặc cô lập các chất chuyển hóa sinh hóa từ huyết tương, nước tiểu, dịch cơ thể, huyết thanh
• Xác định sắc tố có trong tế bào của thực vật, kiểm nghiệm tinh dầu, alcaloid bằng sắc kí lớp mỏng TLC
• Phát hiện sự có mặt của thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc để nhận biết hóa chất trong một chất có sẵn.
• Được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, để phân tách và xác định màu sắc, chất làm ngọt và chất bảo quản
• Cải tiến kết hợp phương pháp sắc kí truyền thống để tự động hóa một số bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng qua đó cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này có tên gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC – HPTLC).

Ưu nhược điểm của Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Tài liệu tham khảo về sắc kí lớp mỏng

1. Marina Santiago, Scott Strobel, Thin layer chromatography, pubmed.ncbi.nlm.nih.gov. Truy cập ngày 17/10/2022
2. Thin Layer Chromatography, chem.libretexts.org. Truy cập ngày 17/10/2022
3. THIN LAYER CHROMATOGRAPHY, chemguide.co.uk. Truy cập ngày 17/10/2022