Yêu cầu và phương pháp cố định enzyme và tế bào

Định nghĩa enzyme

Enzyme là một chất có khả năng xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống. Chúng tham gia và điều hòa tốc độ các phản ứng này nhưng không bị biến đổi khi kết thúc phản ứng.

Enzym ở dạng tự do thường không bền dưới các ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và rất khó tách chiết hay tinh chế, thu hồi từ hỗn hợp phản ứng sau khi sử dụng.

Định nghĩa tế bào

Tế bào là một đơn vị sống cơ bản, chúng bao gồm các phân tử cấu tạo nên sự sống. Từ tế bào tất cả các sinh vật được hình thành. Một tế bào cũng được coi là một sinh vật hoàn chỉnh như các vi khuẩn hay vi nấm. Các tế bào với các chức năng khác nhau kết hợp để tạo thành các cơ thể đa bào lớn hơn như người hoặc các loại động vật khác. Mặc dù tế bào lớn hơn rất nhiều các nguyên tố nhưng kích thước của chúng vẫn còn rất nhỏ, chỉ khoảng vài mcm.

Định nghĩa kỹ thuật cố định enzyme và tế bào

Cố định enzyme và tế bào là một kỹ thuật giúp tối đa hóa các ứng dụng của tế bào và enzym. Bằng việc cố định các tác nhân xúc tác sinh học này trong các vật liệu khác nhau, có thể làm tăng sự toàn vẹn, cho phép tái sử dụng và cải thiện hiệu suất tạo sản phẩm. Trong những thập kỷ gần đây, các kỹ thuật cố định đã được phát triển một cách mạnh mẽ. Nó có thể được phân loại theo nguồn nguyên liệu sử dụng ở dạng tự nhiên hay tổng hợp hoặc dựa theo cơ chế cố định enzyme, tế bào.

Ưu nhược điểm của phương pháp cố định enzyme và tế bào

Ưu điểm

• Ổn định được tế bào và enzym trong và sau sử dụng.
• Có thể tái sử dụng các xúc tác sinh học này. Do đó giảm được chi phi tinh chế sau sử dụng.
• Dễ dàng tách sản phẩm.
• Khi có sự cố trong quá trình xảy ra có thể dễ dàng ngừng phản ứng.
• Có thể tự động hóa hoặc cơ giới hóa một cách dễ dàng khi chuyển sang phản ứng liên tục.
• Có thể kết hợp nhiều enzym, tế bào trên cùng hệ cố định để tạo thành một chuỗi phản ứng enzym hoặc tế bào.

Nhược điểm

• Hoạt tính của của các tác nhân xúc tác sinh học bị suy giảm khi bị cố định.
• Phản ứng khó diễn ra hơn do cơ chất và enzym/ tế bào khó tiếp xúc được với nhau (bị ngăn cản vật lý bởi các tác nhân cố định).
• Có thể xảy ra sự cạnh tranh giữa các chất mang và enzyme với cơ chất.
• Khả năng sống sót của tế bào ở dạng cố định khó hơn tế bào tự do.

Cấu trúc hệ cố định enzyme và tế bào

Hệ cố định gồm 2 phần chính là chất mang và chất xúc tác sinh học- enzyme hoặc tế bào.

Chất mang: gồm 2 loại vô cơ và hữu cơ:

• Các chất vô cơ: hay sử dụng như bentonite, silica, thủy tinh, các kim loại và oxit của chúng.
• Các chất hữu cơ: chủ yếu là các polyme, gồm 2 loại tự nhiên và tổng hợp. Polyme tự nhiên gồm có cellulose, dextrans, agar, agarose, chitin, alginate và các protein nhu (collagen, albumin). Polyme tổng hợp phổ biến là dạng polyacrylamide, polystyren, polyamide…

Yêu cầu của hệ cố định enzyme

Yêu cầu enzym

• Đủ tinh sạch, không nhiễm các enzym khác- tránh cạnh tranh cơ chất hoặc tạo các sản phẩm tạp.
• Giữ được hoạt tính- đây là yêu cầu tiên quyết. Nếu không giữ được hoạt tính thì việc cố định cũng không có ý nghĩa.

Yêu cầu với tế bào

• Chứa enzym nội bào, và enzym này phải có hoạt tính mạnh để thu được sản phẩm nồng độ cao và ít tạp.
• Không có các enzym khác trong tế bào can thiệp vào phản ứng của enzyme mong muốn.
• Sản phẩm phải đi qua được màng tế bào. Nếu không qua được, phải phá hủy tế bào để thu sản phẩm- khó khăn khi tinh chế.

Yêu cầu của chất mang

• Bền với nhiệt độ, pH, vi sinh vật và các tác nhân hóa học.
• Phương pháp đơn giản.
• Giữ được hoạt tính của hệ trong thời gian dài.
• Không hoặc ít độc với enzym, tế bào.
• Giá thành hợp lý.

Các phương pháp cố định enzyme và tế bào

Dựa theo bản chất liên kết giữa các tác nhân xúc tác sinh học với chất mang có thể chia các phương pháp cố định thành 2 loại là hóa học và vật lý. Phương pháp hóa học gồm tạo liên kết đồng hóa trị, tạo các liên kết chéo…; phương pháp vật lý gồm hấp phụ, bẫy-bao gói. Cố định enzyme có thể sử dụng cả phương pháp vật lý và hóa học trong khi tế bào chỉ sử dụng phương pháp vật lý.

Phương pháp hóa học

Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị

Tạo các liên kết đồng hóa trị của các nhóm chức trên chất mang không tan trong nước với các nhóm chức của enzym.

Ưu điểm của phương pháp là khả năng bền vững, giữ chặt được enzyme; các chất mang sử dụng đa dạng với nhiều loại polyme khác nhau, có thể thay đổi các nhóm chức của chất mang này để thu được liên kết thích hợp với tùy loại enzym.

Nhược điểm: điều kiện thực hiện phức tạp, có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzim do các liên kết này làm che trung tâm hoạt động của enzym (nơi gắn với cơ chất) hoặc làm biến đổi trung tâm điều hòa của chúng; không thể tái sử dụng được chất mang, chi phí cao hơn.

Phương pháp tạo liên kết ngang (liên kết chéo)

Cơ chế: không cần sử dụng các chất mang mà chỉ cần các tác nhân để gắn các enzym lại với nhau thành một đại phân tử không tan. Tác nhân hay sử dụng là glutaraldehyde. Tác nhân này có 2 nhóm aldehyd, mỗi nhóm liên kết với amin của một enzyme.

Ưu điểm: Enzyme được tạo thành một khối nên ít bị rửa trôi; tăng tính chống chịu của enzyme với các tác nhân gây biến tính như nhiệt độ, muối, pH…

Nhược điểm: lượng enzyme cố định được ít hơn các phương pháp khác; giảm hoạt tính của enzyme (tương tự với phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị); giá thành cao.

Phương pháp vật lý

Phương pháp bẫy và bao gói

Cơ chế: enzym/ tế bào được bẫy trong mạng lưới polyme, cơ chất sẽ xuyên qua polyme để tiếp xúc với enzym/ tế bào để xảy ra phản ứng. Các bao gói này gọi là các vi nang với kích thước từ 1 đến 100 mcm. Các chất mang sử dụng như polyme tổng hợp (polyacrylamide, polyvinyl, polyurethane), các loại thạch, alginate, carrageenan.

Ưu điểm:

• Các gel này dễ dàng định vị enzyme và tế bào.
• Mạng lưới trùng hợp kích thước càng nhỏ thì khả năng giữ chặt được enzyme và tế bào càng tốt.

Nhược điểm:

• Sự phân bố đồng đều của enzym hay tế bào thấp, chỗ nồng độ cao chỗ nồng độ thấp. Do đó, ở những nơi nồng độ cao sẽ xảy ra hiện tượng cản trở việc tiếp xúc của các tác nhân xúc tác sinh học này với cơ chất làm tốc độ và hiệu quả giảm xuống.
• Không tái sử dụng được chất mang do đã tạo thành gel, và các liên kết không thể hồi phục.

Một vài ứng dụng của phương pháp cố định enzyme và tế bào trong dược phẩm:

Sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp kháng sinh Beta-lactam: 6-APA, 7-ACA, 7-ADCA

Nguyên tắc: sử dụng enzym hoặc tế bào để thủy phân nhóm amid của penicilin G để thu khung 6 APA.

Chất xúc tác sinh học: enzyme penicillinamidase hoặc tế bào E. coli, B.megatherium. Tế bào 2 vi khuẩn có các tiêu chí để thực hiện cố định là có enzyme Penicillinamidase nội bào, thủy phân được pe G nhanh, 6-APA sau khi tạo thành sẽ được đưa ra khỏi tế bào; pH= 9,0 ổn định được sản phẩm.

Chất mang sử dụng: các polyme như polyacrylamide, alginate… có thể sử dụng các phương pháp bẫy vật lý để cố định các tác nhân xúc tác này.

Sản xuất acid amin

Nguyên tắc: sử dụng enzyme aminoacylase để chuyển hỗn hợp racemic của các acid amin thành dạng L. Enzym này được sử dụng để sản xuất các acid amin bằng phương pháp hóa học (tạo ra hỗn hợp cả D và L của acid amin).

Tác nhân xúc tác sinh học: enzyme amino acylase.

Chất mang: DEAE sephadex- một loại nhựa tích điện dương, nên chúng có khả năng tương tác với các nhóm tích điện âm của enzym (carboxylic).

Sản xuất L-aspartic

Cố định tế bào vi khuẩn Brevibacterium flavum (chứa enzym aspartate) bằng phương pháp vật lý. Gói chúng trong gel của polyacrylamide.

Sản xuất siro fructose: cố định enzyme glucose isomerase.

Tài liệu tham khảo

Slide học phần “công nghệ vi sinh”- bài “kỹ thuật cố định enzyme”-ThS Lê Ngọc Khánh.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780444641144000078

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23934795/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26795964/

https://www.britannica.com/science/enzyme

https://www.britannica.com/science/cell-biology

Xem thêm: [Chia sẻ] Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất enzym